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ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准 农业部869号公告-2-2007 转基因生物及其产品食用安全检测 模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性 试验方法 Food safety detection of genetically modified organisms and derived products Method of target protein digestive stability in simulative gastric and intestinal fluid 2007-06-11发布 2007-08-01实施 前 言 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准归口全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会。 本标准起草单位：农业部科技发展中心、中国农业大学。 本标准主要起草人：黄昆仑、唐茂芝、段武德、罗云波、贺晓云、刘信、宋贵文、沈平、许文涛、厉建盟。 转基因生物及其产品食用安全检测 模拟胃肠液外源蛋白质消化稳定性试验方法 1 范围 本标准规定了外源蛋白质在模拟胃液和模拟肠液消化稳定性的检测方法。 本标准适用于转基因生物及其产品中外源基因表达蛋白质或者用微生物表达的与植物中的外源蛋白具有实质等同性的蛋白质产物在模拟胃液和模拟肠液消化条件下稳定性的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 外源蛋白质 exogenous protein 从转基因生物中提取的通过基因工程手段转入生物中的外源基因所表达的蛋白质产物，或者将转基因植物中的外源基因转入微生物中所表达的与植物中的外源蛋白质具有实质等同性的蛋白质产物。 2.2 模拟胃消化液 stimulated gastric fluid （SGF） 模拟人体胃液中的pH值，盐离子浓度及胃蛋白酶浓度设置的消化液。 2.3 模拟肠消化液 stimulated intestinal fluid （SIF） 模拟人体肠液中的pH值，盐离子浓度及胰酶浓度设置的消化液。 2.4 稳定对照蛋白 stable control protein 为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中60 min内不能被完全消化的蛋白质。 2.5 不稳定对照蛋白 labile control protein 为确认模拟消化体系正常工作而选取的在模拟胃/肠液中2 min内完全被消化的蛋白质。 3 原理 根据人体胃/肠消化液的主要成分及消化环境，在体外建立模拟胃/肠消化体系，将转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在该体系中进行消化，对不同消化时间的样品进行蛋白电泳和蛋白印迹，确定该蛋白在模拟胃液和模拟肠液中被消化的时间，推断转基因生物及其产品中外源基因表达的蛋白质在模拟人体胃/肠消化过程中的稳定性。 4 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯化学试剂和重蒸馏水。 4.1 模拟胃消化液（SGF）：本标准中采用的胃蛋白酶（pepsin）活力不能低于2000 U/mg。 根据公式（1）计算100 mL模拟胃液中的胃蛋白酶的添加量： 5×106 19×B 式中： A—胃蛋白酶添加量，单位为毫克（mg）； B—胃蛋白酶活力，单位为单位活力每毫克（U/mg）。 称取0.2 g 氯化钠（NaCl）和A mg胃蛋白酶，加入70 mL重蒸馏水，加入730 μL盐酸，再用盐酸调pH至1.2，加水定容至100 mL。现用现配。 4.2 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液：称取0.8 g 氢氧化钠（NaOH），溶于重蒸馏水中，定容至100 mL。 4.3 模拟肠消化液（SIF）：本标准中采用的胰酶（pancreatin）应满足40℃ 5min内，能将其质量的25倍的淀粉转化为水溶性的碳水化合物； 40℃ 60min内（pH 7.5），消化掉其质量的25倍的酪蛋白；37℃（pH 9.0），每毫克胰酶每分钟能够从橄榄油中至少水解生成2 μmol脂肪酸。 称取0.7 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）溶于25 mL重蒸馏水中，振荡使之完全溶解，加入19 mL 0.2 mol/L 氢氧化钠溶液和40 mL重蒸馏水，加入1.0 g胰酶，用0.2 mol/L 氢氧化钠溶液调pH 至7.5，加重蒸馏水定容至100 mL。现用现配。 4.4 样品蛋白溶液： 4.4.1 模拟胃液消化样品蛋白溶液（5 g/L）：称取5 mg 样品蛋白，定容于1 mL重蒸馏水中，混匀。 4.4.2 模拟肠液消化样品蛋白溶液（2 g/L）：称取2 mg 样品蛋白，定容于1 mL重蒸馏水中，混匀。 4.5 不稳定对照蛋白溶液： 4.5.1 模拟胃液消化不稳定对