苹果梨果实着色相关PAL基因片段克隆及表达分析.pdfVIP

第 34卷 第 1期 延 边 大 学 农 学 学 报 Vo1．34NO．1 2012年 3月 JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversity Mar．2O12 苹果梨果实着色相关 基因片段克隆及表达分析 孙百灵， 王旭， 曲柏宏 (延边大学农学院，吉林 延吉 133002) 摘要 ：以苹果梨果皮为试材 ，克隆了苹果梨果实着色相关 PAL基 因片段 ，GenBank登录号为JN120855。结果 表明：该基因片段长度为407bp，与鸭梨尸AL基因序列一致性达 97 ，与鸭梨氨基酸序列同源性最高，酶切位 点分析表明，该PAL基因序列含有常用的限制性 内切酶AccI的识别位点 半定量 RT-PCR分析表明，随着 果实的成熟，套袋果与未套袋果PAL基因的表达量都不断增加，但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未 套袋果。 关键词 ：苹果梨 ；果皮；着色 ；PAL；表达分析 中图分类号：$661．2 文献标识码 ：A 文章编号：1004—7999(2012)01一OOOl～05 果实 的红色或紫色是花青素的颜色 ，通常以花青苷的形式存在 ，花青苷是一种配糖体 ，水解时产生花青 素配糖基与糖类 。目前对花青苷形成机制和影响因素已有详细报道[1]，甚至有人对花青苷生物合成的遗 传和发育调控也进行了研究 ]。 苯丙氨酸解氨酶(PAL)是花青苷合成途径 中至关重要的酶，能阻止戊糖代谢 中形成的苯丙酮酸与氨结 合生成苯丙氨酸向形成蛋白质方向发展，促进该途径朝着合成花色素方 向进行_4]。该实验室通过对 “套袋苹 果梨果实着色生理机制”的研究，发现苹果梨果实着色过程 中主要受PAL的影响，因此该试验成功地克隆 了 “苹果梨”果皮 PAL基因片段 ，GenBank登录号为JN12O855，并对该基因片段在不同发育阶段 的套袋果 与未套袋果进行半定量表达分析研究，从亮度上判断PAL活性与 苹‘果梨 ’果实着色的关系，从分子生物学 角度探讨苹果梨果实着色的生理机制 ，为进一步探明梨果实着色的分子机理提供理论依据。 1 材料与方法 1．1 材 料 采用延边华龙集团果树场绿色苹果梨示范基地的苹果梨果实。 1．2 方法 1)套袋处理、取样时期及样品处理 套袋种类选择单面蜡质的洛川双层纸袋。套袋时期为盛花后4--5 周。在采前 18d进行解袋处理 。分别在果实膨大期、着色期 (前期、中期、后期)和成熟期取样 ，未套袋的作 为对照(CK)，保证未套袋与套袋处理的取样条件一致 。取样后 ，果皮用锡箔纸包好 ，液氮速冻并保存在 一 8O℃冰箱中备用。 2)苹果梨果皮总RNA 的提取及 cDNA合成 分别参考王西成等_5]、BekesiovaI等[6]和 PorebskiS 等 的核酸提取方法改进而成的CTAB法提取果皮总 RNA。将 RNA溶于 3O L的DEPC-HzO 中，在 1．2％的琼脂糖凝胶上电泳检测总 RNA的完整性 ，电压 5V／cm，并用紫外分光光度计测定总 RNA 的 260 和 280rllT1的OD值，即A 和A。。，其余置于--80℃冰箱中保存备用 。 用宝生物工程 (大连)有限公司 (Takara)M-MLV(RNaseH一)反转录酶合成 cDNA第一链 ，以 Oligo (dT)。为反转录引物 ，起始 RNA为3z／L总RNA。 收稿 日期 ：2011～12—26 基金项 目：国家 自然科学基金项 目；国家 自然科学基金项 目 作者简介：孙百灵(1985一)，女，吉林榆树人，延边大学农学院，在读硕士。曲柏宏为通讯作者， TelE—mail：bhqu@ybu．edu．err 2 延 边 大 学 农 学 学 报 第 34卷 3)苹果梨果实 PAL基因的RT—PCR扩增 对 NCBI上已经登录的西洋梨和鸭梨栽培品种的PAL核 苷酸进行多序列 比对 ，利用 Oligo6软件设计 1对特异引物 ，对苹果梨果实 PAL基因进行 RT-PCR扩增 ，引 物序列为