细胞磷脂的制备.docVIP

第三章 细胞磷脂的制备 引言 细胞磷脂的分离 2.1 动物细胞磷脂的制备工艺 2.2 植物细胞磷脂的制备工艺 2.2.1 植物混合磷脂的制备 2.2.2 磷脂酰胆碱的分离 2.2.3 肌醇磷脂的分离 2.2.4 磷脂酰乙醇胺的分离 磷脂的分离鉴定 3.1 磷脂中磷含量的定量分析 3.2 薄层色谱法分离鉴定磷脂 经典的TLC技术用于分离磷脂的各组分，优点在于设备简单，操作方便，分离条件易于掌握，而且结果直观。可以用于定性地分析磷脂中各主要组分，亦可以进行少量产品的提纯。但成本较高。 一般的TLC分离方法是在距底部1.0cm 处点样，然后将薄板放置在用展开剂饱和的展开槽中，溶剂的高度距底部0.5cm,展开至顶端1~2cm处，在通风橱中干燥后显色。如用荧光硅胶铺板展开，亦可在紫外灯下观察。上述过程称作单向二维展开。 在双向二维展开过程中，点样位置与单向二维展开不同。样品点在距底部和左边各1cm处。首先将板放在展开槽中展开。一般展开剂为中性溶剂，展开距顶端1cm处，将板取出，放在通风厨中干燥。然后将板转90o 放入第二个展开槽中，展开剂一般为酸性展开剂，展开至顶点1cm处。将板取出，放入通风厨中干燥[8]。 磷脂对于紫外灯的灵敏度较低，故薄板的显色除可用荧光板的紫外显色外，还可用显色剂显色。 J.Dittmer 成功地制备了磷脂类显色剂[23]。由于磷脂中有些物质对普通的显色剂不显色，J.Dittmer 用MoO3或茚三酮、或若丹铭制成显色剂对磷脂的各组分进行显色。制备方法是将H2SO4加入MoO3沸腾，然后加入钼粉，制成磷脂类专用试剂 Dittmer 试剂。J.Dittmer 等人同时对蛋黄磷脂中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺对各种显色剂的敏感度进行了分析。 薄层色谱法分离磷脂混合物主要用于定性分析。D.Medh 和H.Weigel[24]用两步单向二维TLC展开法分离了PC、PE、PI、PA的4,5—二磷酸酯和4—单磷酸酯。这种方法采用了两种不同的溶剂展开系统在同一方向上对混合磷脂进行展开。这种方法可以定性和定量地分析磷脂中的各组分。 D.Allan等人对薄层色谱分离磷脂进行了一些改进，用EDTA处理硅胶板。处理后的硅胶板能将蛸磷脂和其他磷脂分开。这种方法对于研究阴离子型磷脂的降解产物具有很明显的优点[25]。 郭勍等人用二次展开的薄层色谱方法，对大豆混合磷脂组成的各组分进行分析，获得了大豆磷脂中11个重要组分的定性结果[26]。 用薄层色谱分离磷脂各组分，并对其定量是可行的。但也只限于定性和定量分析的手段。不能用于大量制备各磷脂组分。 3.3 柱色谱分离磷脂 在1960~1970年之间，人们开始利用柱色谱技术分离磷脂混合物。当然，在磷脂化学和生物学领域发展到今天，它也是一种证明结构研究中获得微克数量级的一种分离方法。 在利用柱色谱分离磷脂的发展过程中，可以使用的有Florisil柱、Sephadex柱、Factice柱及离子交换柱[69]。其中使用比较广泛的是硅胶柱和氧化铝柱，并且在柱色谱中占主要地位。尽管如此，在大部分细胞磷脂的结构被确定以后，该方法逐渐被遗忘了，并且被薄层色谱和高效液相色谱所代替。但由于它的高效率、洗脱溶剂用量低以及污染小、样品损失小等优点，它还有一些重要应用。比较典型的柱分离是Bulk分离[22]。 Bulk分离：用硅胶色谱柱分离中性磷脂和其他磷脂组分的方法。硅胶柱为Silicarcc--7或SilicARCC--4填充玻璃或Teflon柱子样品量为每2g硅酸含1mg磷脂，用正己烷洗涤。中性磷脂洗脱以后，其他的磷脂用氯仿:甲醇（1:10，v/v）冲洗。此种方法可以将中性磷脂和其他磷脂完全分开。 此种方法同样可以在氧化铝柱子上实施。 近年来，对于柱色谱在磷脂分离上的应用又有新进展。Theresa. Horne[27]利用Empore--SDB做填料，分离红血细胞磷脂，减少了分离时间和溶剂用量，获得了较好的分离效果。这种方法利用Emproe盘分离磷脂得到PC、PE、PI、SPh近92%的收率，PS为65%，溶剂的用量和时间相对于液—液分离减少了80% 。47mm 盘可容纳上述五种磷脂超过0.3mg。 M.Sosada[28]利用低硅胶/磷脂比对菜油磷脂进行抽提。抽提条件为：60oC , 95%的乙醇，硅胶/磷脂为2:1。最终产物中PC含量从原料中的50%增加到80%。Kim. H.Y[29]又对色谱柱进行改进，用2—氨基丙基做柱填料进行分离。这种方法对磷脂中的中性组分和酸性组分能进行较好分离。并且对胆固醇，甘油醇，以及PC、PE、PI、PA、PS和SM的回收率很高。 有关柱层析分离提纯方面的研究，国外有一些报道[75]。将磷脂混合物溶于CHCl3-CH3(1:1)中添加A