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高效液相色谱-荧光法测定人尿液中氧氟沙星的浓度 【实验目的】 1． 掌握氧氟沙星尿液样品的收集、处理方法和尿药累积排泄率的计算方法。 2． 熟悉氧氟沙星尿液样品的预处理方法好测定步骤。 【实验原理】 氧氟沙星为喹诺酮类抗菌药，化学名(+/-)-9-氟-2,3-二氢-3-甲基-10-(4-甲基-1-哌嗪基)-7-氧代-7H-吡啶并[1,2,3-de]-[1,4]苯并恶嗪-6-羧酸 （C18H20FN3O4 361.38） 环丙沙星（内标），化学名1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉酸 （ C17H18FN3O3 331.35） 1． 尿液中药物浓度的测定可以计算药物的排泄量及排泄率，在某些缺乏严密医护条件不便于对给药对象多次采血情况下，尿药排泄数据可以用来求算药动学参数；一般抗菌药物很容易通过尿液以原形药物形式排出体外，可以表征当时体内的药量。 2． 氧氟沙星具有长共轭刚性结构，可以采用荧光检测器检测，由于体内内源性物质能够产生荧光的可能性很小，因此，荧光检测可以有效地减小内源性物质的干扰，同时增加检测灵敏度，满足了体内药物分析干扰多、含量低的特点。 3． 氧氟沙星具有酸碱两性，在水溶液中发生解离，因此选择偏酸性的色谱条件可以有效地抑制其拖尾或者色谱峰对称性差的缺点，获得较好的色谱分离效果；由于尿液中浓度较大，可以采用直接稀释后离心的前处理手段，以获得适合于色谱分析的样品。 【仪器与试药】 高效液相色谱仪-荧光检测器，分析天平，离心机，超声波清洗器，恒温水浴锅，涡旋混合器，微量注射器；离心管，微量移液器，容量瓶，量筒；氧氟沙星片（每片0.1克），氧氟沙星对照品，环丙沙星对照品，甲酸，三氯乙酸，乙腈，甲醇，二次蒸馏水。 【实验步骤】 1． 生物样品采集与保存 给药与收集尿液：健康志愿受试者隔夜、禁食10小时，收集给药前的尿液作为空白对照；于实验当日晨单次空腹口服氧氟沙星片1片（每片0.1克），200ml温开水送服。实验2小时后可适量饮水，4小时后进统一清淡午餐，分段收集给药后0-2、2-4、4-8、8-12和12-24小时尿液，准确测量体积，滤过，于-20℃冷冻保存、待测。 2． 对照品溶液制备 （1） 氧氟沙星标准溶液：精密称取氧氟沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用乙腈溶解，并稀释制成每1ml含100ug的标准储备液，精密量取氧氟沙星标准储备液适量，用水稀释制成浓度分别为100、200、500、1000、2000、3000和4000ng/ml的氧氟沙星标准系列溶液。 （2） 环丙沙星内标溶液：精密称取环丙沙星对照品10mg，置100ml量瓶中，用水溶解，并定量稀释成每1ml含100ug的储备溶液；精密量取该溶液1ml置100ml量瓶中，用水稀释至刻度配成1.0ug/ml的标准溶液。 以上溶液均在4℃条件下冷藏。 3. 尿液样品前处理 取冷冻的尿液样品，在37℃水浴下解冻，经适当稀释后，精密吸取500ul，置2ml具塞离心管中，精密加入环丙沙星内标溶液50ul，再加入200ul10%三氯乙酸混匀后高速离心，取上清液20ul进样分析。 4. 方法学确证 （1） 特异性评价：对6份不同志愿者空白尿液进行上述样品预处理，分别进样液相色谱分析，在氧氟沙星与内标保留时间位置未有内源性物质干扰出现，则证明本方法可以很好地排除尿液对氧氟沙星测定的干扰。 （2） 尿液标准曲线制备：取空白尿液450ul,分别置10ml具塞离心管中，精密加入上述配制的氧氟沙星标准溶液50ul，得氧氟沙星浓度分别为10、20、50、100、200和400ng/ml标准尿液样品。按“尿液样品前处理”步骤操作，自“精密加入环丙沙星内标溶液50ul”起，同法处理，进样20ul，记录色谱图。以氧氟沙星浓度为横坐标，氧氟沙星与内标的峰面积笔直为纵坐标，求得的直线回归方程即为标准曲线。 （3） 准确度、精密度和最低定量限：取空白尿液450ul，按“标准曲线”项下的方法分别制成含有氧氟沙星浓度为10、20、100、和300ng/ml的最低定量限及低、中、高三个浓度的质量控制尿液样品，每一浓度进行5个样本分析，根据标准曲线，计算质控样品中氧氟沙星的实测浓度。根据质控样品中氧氟沙星的实测浓度，计算本法的精密度与准确度。 （4）1，43，6-二脱水-D-山梨糖醇-5-硝酸酯1,4:3,6-二脱水-D-山梨醇二硝酸酯 （C6H9NO6 191.14） 选择结构类似物硝酸异山梨酯为内标，化学名1,4:3,6-二脱水D-山梨醇二硝酸酯C6H8N2O8 236.14） 【实验材料】 气相色谱