土壤细菌DNA的抽提及分析.pdfVIP

维普资讯 第 25卷第 1期 浙江师范大学学报 (自然科学版) Vo1． 25，NO．1 2002年 2月 JOURNALOFZHEJIANGNORMALUNIVERSITY(Nat．Sci．) Feb．2002 文章编号 i1001-505卜(2002)01·0056—06 土壤细菌 DNA 的抽提及分析 边才苗 ， 李钧敏 ， 施 时迪 ， 张崇邦 (台州师范专科 学校 生化 系，浙江 临海 317000) 摘 要 ：应用不 同的方法从 土壤 中分离 细菌 DNA，以紫外分光光度 法及琼脂糖 凝胶 电泳法分 析所得细菌 DNA 的纯度与得率 ，比较不 同的细菌收集缓 冲液 、细菌裂解缓 冲液、细菌裂解过程及不 同的抽提修饰步骤对 土壤细菌 DNA抽提结果的影响 ，确定了最佳 的土壤细菌 DNA抽提方案．以该方案对土壤细菌 DNA进行 了 大规模 的抽提 ，所得产物 的Azs。／Az为 1．68，Azs。／Az。。为 0．87，得率 (DNA／干土)为 1．90btg／g．在 土壤细 菌 中加入 1“g标准 DNA进行 了3次 回收实验 ，平均 回收率为 82．33 ． 关键词 ：土壤细菌 ；DNA；抽提 中图分类号 ：Q938 文献标识码 ：A 土壤 中含有许 多微生物 ，包括细菌 、真菌 、放 体抽提细菌 DNA，以紫外吸收值及凝胶 电泳结果 线菌与原生动物等 ，其 中细菌是土壤生物 的主要 分析所得 DNA 的质量 ，并 比较 了几种土壤细菌 类群 ，个体小 、数量多、繁殖快 ，在物质循环 中起着 DNA 的提取方法 ． 关键 的作用．这些细菌可通过 吖啶橙染色在荧光 1 材料与方法 显微 镜 下 被 直 接 观 察，其 中大 约 有 99．5 ～ 99．9％的细菌无法被人工培养 ，这成为土壤微生 1．1 材料 与仪器 物分子生态 学发展 的一个 限制性 因素．利用分子 土壤于 2001年 2月 16日采 自浙江省天台山 生物学方法从 自然环境 中提取细菌 的核酸 ，是一 (29。15N，121。06 E，主峰海拔 1098m)，采样地 种有效 的可用于分析这些不可被培养 的细菌的方 海拔为 930m，取表层 0cm～5cm 土壤 ，土壤性 法[1]．国外对土壤细菌 DNA抽提 的方法研究不 质为黑壤土 ，土壤含水量 (H：0)为 22．O2 ，土 多，国内则更少．从土壤 中抽提细菌 DNA 多应用 壤 中 (有机质)为 49．7t~g／g，pH 值为5．24，孔 以下两种方法 ：用机械方法破碎细菌细胞 [2]，或用 隙度为41．9 ，凋落物较多． 溶菌酶 、蛋 白酶及十二烷基硫酸钠 (SDS)或十六 所用仪器为岛津 UV2401-PC型紫外分光光 烷基三 甲基溴化胺 (CTAB)裂解细菌细胞来获取 度计 ，ZF-1型紫外反射透射 分析仪 ，TGLL-18G DNAL3J．机械方法破碎细菌细胞可增加 DNA得 台式高速冷冻离心机 ，SCR-4高压 电泳仪 ，Leica 率 ，但 同时 DNA 也被打断，获得 的 DNA 大小为 数码相机． 5000 10000碱基对 (basepair，bp)或更小 ，这 1．2 细菌收集方法 样 的 DNA 很 难 满 足 分 子生 物 学 的进 一 步 研 1．2．1 偏磷酸钠一Chrombach缓冲液法[3] 究 ．为 了获 取 符 合 分子 生 物 学 操 作 要 求 的 取土壤 0．75g置 5mL离心管 中，加入 3mL DNA，笔者结合 国外文献报道 ，经实验改进 ，以溶