柱前衍生化高效液相色谱法测定酶法拆分的DL半-胱氨酸含量.pdfVIP

第 45卷 第 期 南 开 大 学 学 报 (自然科学版) 2012年 2月 ActaScientiarumNaturali U i rsitdtiN口忌口iensi Vol|45 NO-1 ． ． Feb．2012 文章编号 ：0465—7942(2012)01—0046—06 柱前衍生化高效液相色谱法测定酶法拆分的 DL一半胱氨酸含量 段静静，彭佳敏，曹美荣，李 鸣，侯 洁 (南开大学 药学院，天津 300071) 摘要：建立了以1一氟一2，4-二硝基苯基一5一L一丙氨酰胺 (FDAA)为手性衍生化剂、高效液相色谱法测定半胱 氨酸对映异构体含量 的方法 ．采用 Inertex—C 色谱柱 ，以乙腈一水 (含 0．1 TFA)为流动相进行梯度洗脱 ，L一半 胱氨酸、D一半胱氨酸分别在 (2．50～2O)mmol／I浓度范围内与峰面积呈 良好的线性关 系 (r一0．9983和 0．9984)；其平均 回收率分别为 i00．1 (RSD一0．67％)和 99．6 (RSD=0．92 )．利用上述方法对重组表达 的 ￡一半胱氨酸脱巯基酶拆分 DL一半胱氨酸外消旋体混合物进行考察和优化 ，最终得到纯度为 99．5 的D一半胱 氨酸 ，回收率为 55．54 ． 关键词：柱前衍生化 ；HPLC；L一半胱氨酸脱巯基酶 ；D一半胱氨酸 ；手性拆分 中图分类号 ：0657．72 文献标识码 ：A O 引 言 目前 ，手性氨基酸的拆分方法有以下几种 ：化学拆分法[1]、膜拆分法[2]、酶拆分法口]、萃取拆分法 及 色谱拆分法．其 中，色谱拆分法包括高效液相色谱 (HPLc)法 、配体交换色谱法、薄层色谱法 、快速柱色谱 法和超临界流体色谱法．在这些方法 中，酶法生产手性氨基酸具有显著优势，其特点是酶的催化选择性很 强 ，生产过程简单，成本低 ，产率高，副产物少，适合于工业化生产．通常采用的DL一氨基酸的分析检测方法 是高效液相色谱法．该方法对氨基酸的测定使用一些柱前衍生试剂如 phenylisothiocyanate(异硫氰酸苯 酯)Is3、1-fluoro一2，4-dinitrobenzene(2，4-二硝基氟苯)[67、dansylchloride(丹酰磺氯)l7]、9一fluorenylmethyl chloroformate(甲酸芴 甲酯)_8j、5，5一二硫硝基苯 甲酸 以及 1-fluoro一2，4-dinitrophenyl一5一L—alanine amide(1一氟一2，4一二硝基苯基一5一L一丙氰碳胺，FDAA)_】。。等对氨基酸进行柱前衍生，衍生产物经高压色谱柱 分离后用紫外一可见检测器或荧光检测器检测 ，可对氨基酸进行定性和定量测定．FDAA 由于性质稳定，衍 生化过程中不发生消旋化反应且反应速率一致，分离效果好，精密度高，重现性好等优点而被广泛采用． D一半胱氨酸是L一半胱氨酸的光学异构体 ，为非天然氨基酸 ，其衍生物具有多种药用功能．某些微生物 菌体 内的 一半胱氨酸脱巯基酶 (L—cysteinedesulfhydrase，CD)能将 L一半胱氨酸分解为丙酮酸、H。s和 NH。n ．本研究即是从大肠杆菌JM109中克隆得到 L一半胱氨酸脱巯基酶基因，利用它的表达产物 一半胱 氨酸脱巯基酶来分解 DL一半胱氨酸中的 一半胱氨酸 ，从而得到 D一半胱氨酸．DL一半胱氨酸与手性衍生化 试剂 FDAA进行衍生化反应后 ，所生成的异构体能够通过 HPLC—UV进行分离测定．本研究 自制衍生化 试剂 FDAA，优化了衍生化条件 ，通过手性衍生化反应 ，提高了检测灵敏度，并对分析方法进行了方法学 考察．选用常用的c 色谱柱 ，在常温下即可分离半胱氨酸对映体且达到基线分离，方法的通用性好 ，为半 胱氨酸制备产业化及相关医药保健品的品质鉴定与评价提供了高效、精确、低耗、易操作的分析方法． 收稿 日期 ：2011-04—10 基金项 目：天津市科技支撑计