通常污染细胞的培养物.ppt

* * 11 支原体的检查 支原体是一种无细胞壁缓慢生长的原核生物，通常污染细胞的培养物。约有1%可通过滤菌器 支原体不会超过培养物过度生长，这点与细菌和酵母污染不同 对细胞的生长率影响较小 ；培养液可不发生混浊 细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉 自然界支原体是寄生、共生或腐生 与细胞争夺胆固醇和脂质等 支原体会导致 ①抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成 ②影响细胞的抗原性 ③诱导染色体发生改变 ④干扰病毒复制和模仿病毒的行为 一旦发生支原体污染，污染扩散至实验室其它细胞系的可能性相当大。 抑制细胞壁的抗生素对支原体无效。对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等； 还有泰妙菌素，一种双萜类动物专用抗生素，米诺环素(类似四环素类)。新一代支原体抗生素M-Plasmocin（Invivogen公司，仅用于研究，非人用药），能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体 另外，有专门做支原体检测的试剂盒 检测支原体有两种方法 1.利用DNA染色体的荧光染料Hoechest33258，它对细胞核周围(细胞表面或胞质中)的特殊DNA物质进行染色，可显示支原体污染。荧光显微镜下观察, 镜下支原体为散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。 2.利用DNA探针识别细胞提取物中的DNA支原体特异序列，进行支原体的污染检测。(方法由试剂供应商提供) 12 动物细胞体外培养现状与展望 （1）细胞密度低，产物浓度低 （2）细胞群体在大规模，长时间培养过程中分泌产物 能力易丢失,或产物活性易降低 （3）动物细胞培养基、培养设备以及培养用微载体昂 贵 （4）目前对细胞代谢和生长动力学的研究比较欠缺 （5）在线监控水平技术不完善，限制了优良培养系统 的开发 目前存在的主要问题 六 动物细胞培养应用举例 蛋白在细胞内的定位研究 蛋白质相互作用研究 细胞功能研究 药效评价及毒性研究 1 蛋白质在细胞内的定位研究 质粒转染细胞的方法 基本过程 构建表达质粒 原核扩增质粒 将质粒导入细胞 物理 化学 生物 继续培养细胞 固定染色 显微观察 外源质粒在细胞内的表达方式 瞬时 稳定 影响转染效率的因素 细胞数量与质粒量 细胞代数 2.5ul 2.5ug 2.5×105 2000ul 10cm2 6 1.0ul 1ug 1×105 1000ul 4cm2 12 0.5ul 0.5ug 5×104 500ul 2cm2 24 0.2ul 0.2ug 2.5×104 200ul 1cm2 48 0.1ul 0.1ug 1×104 100ul 0.3cm2 96 脂质体 DNA 细胞数量 培养基 表面积 培养板 细胞复苏传代1－2代比较好，不宜使用传代次数较多的细胞，否则影响转染效率 蛋白质相互作用研究 主要方法有酵母双杂交、GST－Pull Down、EMSA、免疫激光共聚焦、Co －IP等 酵母双杂交：直接的相互作用，但假阳性较多 GST－Pull Down ：体外的直接的相互作用，但不能反应 体内的真实情况，可以用来确证试验 Co －IP：间接的相互作用，目前国际上承认。 构建表达质粒 原核扩增质粒 将质粒导入细胞 继续培养细胞 裂解细胞 收集裂解液 Co －IP基本过程 加入抗体 加入到已经包被的Beads 中 继续孵育过夜 洗涤Beads WB检测 2 药效评价及毒性研究 MTT Assay MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点就是灵敏度高、经济。 由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解的甲瓒有机溶剂对实验者也有损害。 3 利用Matrigel进行3D培养研究细胞功能 Matrigel是商品名，BD公司生产的BD Matrigel细胞外基质来源于富含细胞外基质蛋白的EHS小鼠肉瘤。主要成分是层粘连蛋白，IV型胶原，巢蛋白，硫酸化肝素蛋白聚糖，转化生长因子等。可以在室温下聚合形成与哺乳动物细胞基底膜高度相似的基质