血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定一.ppt

血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定 一、实验目的 巩固人类常见化脓性球菌的基本知识 熟悉其分离培养与鉴定的基本方法 二、实验要求 掌握血液标本中常见化脓性球菌的检验程序及检验方法。 熟悉血液标本中常见微生物的种类。 了解血液标本的采集要点及注意事项 标本 模拟血培养标本 实验方法及技术 无菌操作 细菌分离培养 细菌鉴定：染色、镜检、生化反应等 药物敏感试验 血液标本采集及血培养 培养基的制备 基础培养基（营养肉汤） 牛肉膏 0.3% 蛋白胨 1% NaCl 0.5% pH 7.2-7.6 营养琼脂：营养肉汤添加1.5%琼脂 半固体培养基：营养肉汤添加0.25%琼脂 培养基制备的基本过程 调配成分：加定量蒸馏水， 准确称取各成分，混合 溶解：沸水浴 校正pH：用NaOH校正，高压灭菌后，下降0.1-0.2 滤过澄清 定容、分装：斜面（试管高度的1/3-1/4） 灭菌：121℃ 15-20min 培养基的制备 血液琼脂培养基的制备 将灭菌后的普通琼脂培养基，冷却至50℃左右，以无菌操作加入5-10%的脱纤维羊血，轻轻摇匀（避免产生气泡），分装无菌试管或平皿，凝固后，即成。 培养基的制备 血液标本采集 基本原则 即刻采集、在抗菌药物使用前 在病人发热初期或发热高峰时采集 采血量：成人5-10ml、儿童3-5ml、婴儿1-2ml 根据不同的人、不同的病情选择最佳的采血时间、部位、频率和血容量 增菌培养 标本接种于硫酸镁葡萄糖肉汤中（1:5～1：10），37℃孵育，每日观察，连续7天。如疑有菌生长，涂片、革兰染色、镜检，初步报告。 根据涂片结果，选择相应的抗菌药物进行初步药敏试验 血液标本培养 自动血培养检测系统 原理：细菌和真菌生长时释放CO2，通过各种手段检测CO2来判断阴阳性 培养瓶 需氧、厌氧 小儿专用、结核菌、 高渗、中和抗生素等 分离培养 标本的分离培养 于血液琼脂平板上，分区划线，35℃培养后观察并记录菌落大小、形态、颜色、溶血性等 挑取单菌落涂片、革兰染色、镜检并记录结果 挑取单菌落转接血液琼脂斜面，待进一步鉴定 单菌落 血液标本中常见的病原菌 种类 病 原 菌 G+球菌 金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、草绿色链球菌、肠球菌 G+杆菌 结核分枝杆菌、产单核李斯特菌、阴道加特纳菌 G-球菌 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌，卡他布兰汉菌 G-杆菌 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克雷伯菌、肠杆菌、变形杆菌、沙雷菌、沙门菌、不动杆菌、嗜肺军团菌、嗜血杆菌 真菌 念珠菌、曲霉菌、隐球菌、球孢子菌 厌氧菌 拟杆菌、产气荚膜梭菌 鉴定程序 革兰阳性菌 球菌 杆菌 触酶阳性 触酶阴性 葡萄球菌 链球菌/肠球菌 表皮葡 萄球菌 金黄色 葡萄球菌 腐生葡 萄球菌 α溶血： 肺炎链球菌 草绿色链球菌 β溶血： 化脓性链球菌 无乳链球菌 γ溶血： 牛链球菌 肠球菌 棒状杆菌 梭菌属 芽孢杆菌 李斯特菌 丙酸杆菌 乳酸杆菌 丹毒丝菌 链球菌检验程序 链球菌检验程序 菌 种 optochin敏感试验 胆汁溶菌试验 胆汁七叶苷试验 肺炎链球菌 S + — 草绿色链球菌 R — — 肠球菌 R — + 生化反应鉴别 标本中可疑菌的鉴定 重要生化反应 1）过氧化氢酶试验 取菌于载玻片，滴加3%过氧化氢，有大量气泡为阳性 葡萄球菌“+”； 链球菌“-” 2）氧化酶试验 主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。 对苯二胺 醌类化合物 标本中可疑菌的鉴定 3）凝固酶试验（玻片法） 金黄色葡萄球菌“+” 4）甘露醇发酵试验 金黄色葡萄球菌“+” 标本中可疑菌的鉴定 5）新生霉素敏感试验 抑菌圈直径≤16mm 耐药 抑菌圈直径＞16mm 敏感 表皮葡萄球菌对新生霉素敏感，腐生葡萄球菌耐药 标本中可疑菌的鉴定 6）胆汁溶菌试验 取10%去氧胆酸钠溶液，滴加于被测菌落，37℃孵育30min，观察菌落是否消失 肺炎链球菌 “+” 标本中可疑菌的鉴定 7）菊糖发酵试验 肺炎链球菌 “+” 8）Optochin试验 抑菌圈直径＞ 14mm敏感 抑菌圈直径≤ 14mm，胆汁溶菌试验证实 肺炎链球菌 “敏感” 标本中可疑菌的鉴定 9）杆菌肽敏感试验 抑菌圈直径＞ 10mm， 敏感 抑