人clec鄄2 胞外段crd 重组蛋白纯化与多克隆抗体的制备和活性鉴定.pdf

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(8): 1012~1018 CLEC 2 胞外段CRD 重组蛋白纯化 与多克隆抗体的制备和活性鉴定 1) 2, 3) 2) 2) 2) 2) 1)* 李因涛 吴维宾 洪 谊 王文忠 杨俊武 谢建辉 吴兴中 1) 2) ( 复旦大学上海医学院生物化学与分子生物学系，上海200032 ； 旦大学上海医学院基因中心，上海200032； 3)复旦大学生物医学研究院，上海200032) 摘要 人C 型凝集素样受体(human C-type lectin-like receptor-2 ，hCLEC-2)是新克隆的 型跨膜受体分子，研究表明，它在 病毒感染，血小板活化、聚集，肿瘤转移和信号转导等方面发挥重要作用 通过制备针对其胞外段糖类识别结构域(CRD) 的 抗体来进一步研究该蛋白质的生物学功 及相关信号通路 构建了pET23b-CRD 重组表达质粒，将其转化到大肠杆菌BL21 中，用于hCLEC-2-CRD-His 融合蛋白的表达，经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表明，融合重组蛋白成功获得了高效表达，分子 质量在 18 ku 左右 经鉴定，发现hCLEC-2-CRD-His 表达于包涵体中 为获得高纯度的可溶性蛋白，将包涵体溶于6 mol/L 盐酸胍，并用镍柱进行纯化 纯化后的蛋白质经过透析、再折叠后作为抗原，免疫家兔制备抗血清，抗血清经蛋白G 亲合 层析纯化后用Western blot 等方法进行鉴定，结果显示该抗体能特异性地检测到GFP-hCLEC-2 和GFP-CRD 通过使用该抗 体，进一步发现，在用PMA 和IL-4 诱导单核细胞THP-1 分化的过程中，内源性hCLEC-2 蛋白水平下调，初步揭示了 hCLEC-2 的表达和单核细胞的分化存在一定的联系 因此，该抗体的成功制备将为进一步研究CLEC-2 的生物学功能提供有 利的条件 关键词 C 型凝集素样蛋白，糖类识别结构域，重组质粒，融合蛋白，多克隆抗体 学科分类号 R392，Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2009.00042 [10] 人C 型凝集素样受体(CLEC-2)是一个32 ku 的 引起血小板凝集 采用Rhodocytin 亲和纯化和质 型跨膜受体分子，属于非经典的C 型凝集素超 谱分析表明，CLEC-2 表达在血小板表面，可作为 [1] [2] 家族 ，存在磷酸化、糖基化等多种修饰形式 Rhodocytin 的受体 CLEC-2 与Rhodocytin 或特异 结构上，CLEC-2 分为N 端胞内区、跨膜区、颈区 性抗体结合后，其胞内YXXL 基序的酪氨酸发生 和 C 端胞外区 其胞外区带有糖类识别结构域 磷酸化，促进其与Syk 结合，在依赖Syk 作用下活 (carbohydrate recognition domain，CRD) ，可与多种 化下游磷脂酶 2(PLC 2)信号分子，引起血小板活 酌 酌 配体结合介导细胞信号转导；本实验鉴定出鼠源性 化和聚集[4] Podoplanin 是一个跨膜唾液酸糖蛋白， CLEC-2 存在多种剪切变异体，而人源性CLEC-2 它与肿瘤诱导的血小板凝集、肿