基因组学、转录组学基因的结构分析-3.pdf

基因组学、转录组学 基因的结构分析-3 张百芳 利用核酸-蛋白质互作方法研究启动子 启动子是一段能被蛋白质识别和结合的DNA序列，故检测核 酸-蛋白质相互作用的研究方法都可以用于启动子的研究中。 主要方法： • 足迹法（酶足迹法，化学足迹法） • 电泳迁移率变动实验（EMSA） • 染色体免疫沉淀（ChIP） 1. 足迹法 （Footprinting）：利用DNA 电泳条带连续性中断 的图谱特点判断与蛋白质结合的DNA 区域 基本流程： DNA与蛋白质相互作用 酶切割DNA DNA变性凝胶电泳 分析电泳图谱 （1）酶足迹法(Enzymatic footprinting) ：利用能切割DNA的 酶处理DNA-蛋白质混合物，然后通过电泳进行分析 • DNase I足迹法(DNase I footprinting) 利用DNase I 随机切割双链DNA ，从而确定DNA 结合蛋白 在DNA上结合位点。 • 核酸外切酶III足迹法(Exonucleoase III footprinting) 利用核酸外切酶III （Exo III）的35外切酶活性从3末端 切割双链DNA 的特性，确定蛋白质在DNA 上的结合位点。 dsDNA DNase I 足迹法 单链末端标记 DNA结合蛋白 M No-pro Pro-DNA 酶切消化 DNase I 蛋白质 （控制反应时间） 结合区 变性凝胶电泳 对凝胶上空白区域的DNA进行克隆测序,即可 产生长短不同的片段； 确定结合蛋白质的DNA序列 但蛋白质结合区被保护 （2）化学足迹法(Chemical footprinting) ：利用能切断 DNA骨架的化学试剂处理DNA-蛋白质复合物，从而通 过化学试剂无法接近结合蛋白质的DNA 区域而确定DNA 的蛋白质结合位点 主要方法： •羟自由基足迹法 •体内足迹法 羟自由基足迹法 （Hydroxyl radical footprinting） • 利用化学试剂产生的羟自由基 攻击DNA分子表面脱氧核糖 骨架使DNA断裂 羟自由基 化学试剂 • 当DNA结合蛋白将脱氧核糖 遮盖时，自由羟基无法攻击而 使这个区域的DNA受到保护 变性凝胶电泳 电泳图谱上出现空白区的地方 就是结合蛋白质的DNA 体内足迹法 （In vivo footprinting ） 用化学试剂对活细胞进行体内处理，使DNA在细胞内受到 化学修饰，然后裂解细胞，用化学法或酶法进行足迹实验。 • 甲基化干扰实验(Methylation interference assay)：利用化学 试