一种简单实用快捷凝胶迁移滞后实验 - 第三军医大学学报.doc

一种基于ODDSEY红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）第三军医大学军事预防医学院军事劳动卫生教研室 重庆 400038凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）进的ODDSEY红外荧光成像系统，优化了EMSA实验的程序以及时间过程，提供了一种更加精确安全有效的EMSA方法凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，还可进行未知蛋白的鉴定[1]。近年来,这项技术被广泛应用于转录分子的实验研究。在以往的实验研究中我们发现,采用化学发光自显影技术的EMSA方法，存在着实验周期长，显影时间不稳定，对实验人员健康有影响等不利因素。因此本实验利用先进的ODDSEY红外荧光成像系统，优化了EMSA实验的程序以及时间过程，提供了一种更加精确安全有效的EMSA方法。 取约3×106个N9细胞，5 ml 冰PBS冲洗，收集细胞。加入0.25 ml重悬，冰浴15min；加入25μl NP-40，震荡10s；16000×g离心，30s，4℃；将沉淀重悬于50μl （二硫苏糖醇和）中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，16000×g离心10min，4℃；取上清即为核蛋白，于‐70℃保存，Lowry法测定蛋白质浓度。 １.2制胶及预电泳 制5%的聚丙烯酰胺凝胶，在0.5×TBE中预电泳30。（胶大小：8×8×0.1cm） ５×ＴＢＥ 1 双蒸水 6. 30%聚丙烯酰胺 1. 甘油 10%过硫酸胺 100 TEMED 5μl 胶凝后，拔下梳子，用0.5×TBE冲洗胶孔。然后倒满电泳液，100 V 电压在0.5×TBE电泳液中预电泳30－60mi。 1.3配置反应体系（通常在预电泳的同时进行） 本实验的探针序列：STAT3（signal transducer and activator of transcription） Consensus Oligonucleotide1：5’ -- GAT CCT TCT GGG AAT TCC TAG ATC -- 3’，3’ -- CTA GGA AGA CCC TTA AGG ATC TAG -- 5’。按照下表配制反应混合液： 10 X Binding Buffer（100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH 7.5） 2 μl 25 mM DTT, 2.5% Tween?-20 2 μl Poly (dIdC), 1 μg/μl in 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5 1 μl 1% NP-40 1 μl 100 mM MgCl2 2 μl Water 11μl Stat3 Oligonucleptides 1μl Nuclear extract 1μl 最后加DNA探针结合反应，30℃ 孵育20 min。分别按照浓度梯度取2.5，5，10，12.5μg核蛋白，加入反应混合液，ddH2O补足20μl总体积。冷探针：加入1μl 20 PM未标记探针。 1.4电泳 加入2 μl 10×Orange Loading Dye，上样后，5％聚丙烯酰胺凝胶100V电泳约1h，全程避光。 1.5扫描 设扫描焦点为3.0 mm，700 纳米波长扫描。 根据预先设计的浓度梯度分别加入 2.5，5，10，12.5μg核蛋白（图1 从左到右为1-6泳道），其中5泳道为100倍的冷竞争探针，6泳道为蛋白。我们发现经过微波处理后的细胞出现了明显的STAT3的DNA结合条带，其中在上样核蛋白量为10以及12.5μg时条带非常清晰。而突变的STAT3 寡核苷酸不能竞争抑制STAT3与探针的结合，在蛋白中也不出现结合条带。本实验结果说明微波处理可以激活STAT3核转位，在细胞核内发挥功能。 凝胶迁移或电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。既往的实验研究通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同孵育，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。