试验项目：far-western blot分析cry2ab蛋白和小菜蛾中肠蛋白的相互 .doc

2014-05-02 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：质谱鉴定能和Cry2Ab蛋白结合的中肠蛋白 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2014-05-02 计数月份：2014年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，其特征之一是孢子形成的过程中同时产生伴孢晶体（主要成分是有杀虫效应的δ-内毒素），其中的Cry蛋白是杀虫机理研究最透彻、应用最广的δ-内毒素之一[1,2]。 目前Bt毒素的杀虫机理尚不明确，己被普遍接受的苏云金芽抱杆菌作用机制认为:Bt所产生的C巧毒素蛋白晶体被昆虫取食后，昆虫肠道中的碱性蛋白酶[]将其特异性的水解，使得毒素前体活化为具有杀虫活性的毒素。活化后的毒素能够特异的与昆虫中肠BBMV上的受体蛋白相互结合，然后这种毒素与蛋白的结合体形成空洞使肠道破损[]，这些空洞结构能够让水分子和离子自由穿过，破坏了细胞的通透性，和肠道细胞的内环境，最终导致昆虫的死亡[]。 APN、类钙粘蛋白、ALP、糖脂、肌动蛋白等被推测可能是Bt在小菜蛾BBMV上的受体，但究竟哪种是毒蛋白的主要受体，与毒素结合后对小菜蛾产生致死效应尚未明确[]。本研究采用及分析小菜蛾中肠毒素的受体结合蛋白，从蛋白质水平上来了解小菜蛾对的抗性形成机制，为有害昆虫的抗性治理提供理论依据。试验方法小菜蛾 2.2 主要试剂 Cry2Ab鼠单抗购自上海佑隆生物科技有限公司BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒)Millipore公司。 2.3 实验方法 2.3.1 小菜蛾中肠BBMV的提取 选取四龄末期小菜蛾100头，抽取其中肠，参照Wolfersberger的Mg-EGTA沉降法5μg Cry2Ab蛋白孵育一小时，此时Cry2Ab蛋白的受体可以和Cry2Ab蛋白结合从而把Cry2Ab蛋白结合到PVDF膜上；用抗Cry2Ab蛋白的一抗进行Western Blot进行检测，显影能显出条带的便有可能是Cry2Ab蛋白的潜在受体。 2.3.3 质谱鉴定Cry2Ab蛋白的受体蛋白 将上一步能显影的蛋白条带切下，利用MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定。 试验结果实验通过MALDI-TOF-MS进行蛋白鉴定。 图1 far-western blot 验证Cry2Ab蛋白受体 A 10%SDS分离小菜蛾中肠BBMV; B far-werstern blot寻找Cry2Ab蛋白的受体. 3.2 MALDI-TOF-MS鉴定蛋白 利用Mascot (MatrixScience, UK) 对所鉴定的蛋白进行打分评定，大于34分则可认为所鉴定的蛋白比较可靠。各鉴定的蛋白如下图： 表1 MALDI-TOF-MS鉴定Cry2Ab蛋白的受体蛋白 蛋白条带 鉴定蛋白 得分 分子量 Lane 1 methionine-rich storage protien 1 60 91803 5 Lane 2 midgut target receptor APN 127 51795 23 Lane 3 Arylphorin-like hexamerin-2 768 83011 23 Arylphorin-like hexamerin-1 600 82627 18 pxTransferrin 66 76488 1 Lane 4 vacuolar (V-type)H(+)-ATPase B subunit 283 27409 34 Lane 5 arginine kinase-like protein 230 39978 15 actin, muscle-type A1 400 42248 31 所鉴定的受体蛋白如表一所示，其中的midgut target receptor APN、vacuolar (V-type)H(+)-ATPase B subunit、actin已经多次被报道作为其他昆虫的Cry蛋白受体，这个结果表明利用far-western blot进行Cry蛋白受体验证是可行的；其他的几个受体蛋白未见报道，可以利用RNAi进行反面验证是否是Cry2Ab蛋白的受体。 试验目前主要有2种途径解释Cry蛋白的杀虫机理：经典的细胞膜穿孔途径和钙粘蛋白受体介导的细胞信号转导途径，无论哪种途径都涉及Cry蛋白与昆虫中肠受体的相互作用 实验通过