氧化硫硫杆菌启动子功能片段在大肠杆菌.pdf

遗传学报，17(2);143--147,1990 ActaGeneticaSiruca 氧化硫硫杆菌启动子功能片段在大肠杆菌 中的克隆和表达 颇 望 明 （山东大学微生物研究所，济南） 用DNA体外重组技术，以氧化硫硫杆菌 (T.thiooxidans）染色体 DNA的EcoRI- HindIII片段取代 pBR322的相应片段，构建成一个重组质粒 pSDR12，转化大肠杆菌 C600 受休菌株后，表现了较强的抗四环素能力。表明了一个专性自养细菌的启动子功能片段在异 养细菌中表达。 关键词：氧化硫硫杆菌染色休，专性自养细菌，四环素抗性 按照获得能量和合成细胞成分的方式，细菌可以分为两类：自养细菌和异养细菌。自 养与异养的区别和关系，在生理生化方面已进行了比较深人的研究，但从遗传学角度研究 还刚刚开始。Barros等[3)从氧化亚铁硫杆菌中分离得到一个含有谷氨酞胺合成酶基因的 染色体DNA片段，成功地克隆到大肠杆菌中去，表现了高特异活性，首次证明了一个专 性 自养细菌的结构基因在异养细菌中的表达。近来，Pretoriu：等61〔又将氧化亚铁硫杆菌 的一个固氮基因克隆到大肠杆菌中去。但是，关于自养细菌启动子的研究还未见到报道。 研究自养细菌启动基因不仅有助于了解自养细菌在基因表达方面的特性，而且对于探索 新的基因表达系统具有重要意义。 本文报道了专性自养硫杆菌— 氧化硫硫杆菌启动子DNA片段在大肠杆菌中的克 隆和表达。 材 料 和 方 法 一（）菌种及其培养 氧化硫硫杆菌 Tt-1菌株系我所从山东泰安地区含硫煤矿堆置物中分离得到。E. coliC600受体菌株及HB101(pBR322)菌株由中国科学院微生物研究所提供。氧化硫 硫杆菌采用 Starky培养基，培养方法同前11〔0E.coli用 LB培养基，370C迥旋振荡培 养。 二（）质粒和染色体 DNA 的分离和纯化 菌体在LB培养基培养生长至对数生长期，加入氯霉素 最（终浓度为 1701zg/ml)扩增 16小时，离心收集菌体，参照 Maniatis[Z，用碱法提取，略加改变，在提取后用 RNase 最（ 终浓度为 1oofzglml)处理1小时 3（70C)，再经酚、氯仿抽提和乙醇沉淀。在琼脂糖凝胶 板上电泳分离 cc。构型的质粒 DNA，再经凝胶电泳洗脱纯化[810 本文于 1988年6月 11日收到． 1嘴4 遗 传 学 报 17卷 氧化硫硫杆菌以元素硫为能源，在 Starky无机盐培养基中，30℃培养7天后离心 收集菌体，去除硫粒后，按Yates[61方法分离染色体 DNAO 三（）酶切和连接 取氧化硫硫杆菌染色体 DNASz1g, pBR3221zjg，分别加人 HindIII限制酶，在 37℃水浴中酶切1小时，酶切后用65℃水浴处理5分钟，灭活限制酶，冷却调整至高盐 浓度后，再分别加人EcoRI限制酶在同样条件下进行第二次酶切。然后，将两部分混合 加人 T4DNA连接酶进行连接，4℃反应24小时。 （四）转化 E.coliC600菌体在LB培养基中370C迥旋振荡培养至对数生长早期，离心收集菌 体，用50mmol/LCaC1240C处理20小时，按Cohen4(1方法进行转化。 五（）琼脂糖凝胶电泳及 DNA分子量测定 采用 Tris-醋酸缓冲液 4（0mmo1/LTris,2mmo1/LEDTA,20mmol/L酷酸钠， pH0),琼脂糖浓度为0.7并或1务，电压 100V,3-4小时，凝胶用澳化乙锭染色。 DNA分子量是根据 Meyers等方法E31测定的，以ADNAHindIII酶切片段作为标 准。 六（）工具酶及缓冲液 限制性内切酶 Hindlll,EcoRI,Pstl,BamHl,Sall,T4DNA连接酶是中国医学 科学院基础医学研究所产品，Puull及、RNase为西德BoehringerMannheium 产品， 四环素为山东潍坊制药厂产品 有（效期至199。年7月）。T4