蛋白质组学样品制备注意事项.pdf

蛋白组学样品制备常规流程及注意事项 一、 细胞, 组织裂解 ● Lysis buffer (SDT, RIPA…) ：ThermoFisher 提供了针对于各种样品的解 缓冲液 ● Detergent: SDS, CHAPS, NP40… (破坏细胞膜，蛋白质变性） ● Reducing agent: DTT… (打开二硫键，使得蛋白质结构更为开放，更易 酶解) ● Urea: 增加蛋白质的可溶性，适用于提取全蛋白 二、 蛋白质抽提 三、 样品蛋白质含量测定、还原烷基化 还原烷基化原理: 蛋白质不能从 PAGE 胶里被抽提出，而肽段则可以被抽提 出 ，打断蛋白质的二硫键，破坏蛋白质二级结构，是蛋白质结构松散，增 加蛋白质酶切效率。 四、 蛋白水平的预分级或蛋白质免疫沉淀 五、 蛋白质酶解 i. 胶内酶解 (In-gel digestion) ● 将考染后的 SDS切成小块 ● 用 100mM NH HCO /30%ACN 脱色 4 3 ● 在胶内进行 DTT, IAA ● 在 NH HCO 溶液体系中加入酶，在胶内进行酶解 4 3 ● 用 60% ACN/0.1% TFA 从胶中抽提生成的肽段 ii. FASP: Filter aided sample preparation ● 采用滤膜装置进行溶液置换（10K, 20K, 30K ） ● 使用尿素可以更有效的除去溶液体系中的去垢剂（如 SDS ） ● 最后置换至 NH HCO or TEAB 溶液体系进行蛋白质酶切（pH 在 8.0 左 4 3 右） ● 酶解完成后收集滤膜的流穿组分得到肽段 原理: 蛋白质不能通过滤膜，而酶解生成的肽段则可以通过。丙酮沉淀是另一 种去除去垢剂的方法，从而可进行溶液内酶解。 iii. 蛋白酶的选择 ：  最为常用的蛋白酶: Trypsin （保持胰酶处于低温，并且保存在酸性环境中， 以防止胰酶自身酶解 ） ● 特异的切断 C 端为Arg, Lys 的肽键（若Arg, Lys 后紧跟 Proline, 酶切效 率降低） ● 生成的肽段平均长度为 9 个氨基酸 ● 胰酶酶解生成的肽段至少为 2+价，易于离子化  其他一些蛋白酶 ，酶切位点的特异性可在搜库软件中查找。 六、 肽段水平的预分级或翻译后修饰的富集 七、 肽段除盐 (非常重要) 蛋白质谱分析对样品的要求 ：  无盐：少量挥发性盐不影响（如 100mM 以下碳酸氢铵）（充分脱盐 ）  无聚合物：如 PEG （避免使用国产耗材、避免手套等接触样品 ）  无表面活性剂：如 SDS （前处理过程中避免使用 ）  无沉淀或颗粒 ：（充分离心、过滤 ） 推荐使用脱盐试剂盒： ● Waters 50mg 容量脱盐柱型号：WAT054955 ● Thermo 80ug 肽段脱盐型号：87784 Pierce C18 Tips, 100µl bed 八、 纳升级液相分离和质谱分析