肝脏缺血／再灌注损伤对大鼠瘦素蛋白及mrna表达水平的影响.pdf

维普资讯 中国危重病急救医学 2007年 7月第 19卷第 7期 ChinCritCareMed，July2007，Vo1．19，No．7 ·433 · · 研 究 报 告 · 肝脏缺血 ／再灌注损伤对大 鼠瘦素蛋白及mRNA表达水平的影响 张石玉 林季 颜光涛 冯泽国 【关键词】 缺血预处理 ； 缺血 ／再灌注损伤 ，肝脏 ； 瘦素 ； 放射免疫分析法 ； 逆转录一聚合酶链反应 研究发现，瘦素 (Leptin)不仅作用 表 1 PCR引物序列及反应条件 于体重平衡调控环路和能量代谢反馈调 节过程 ，还能作为炎症细胞 因子在急性 应激反应中发挥一定的作用 “。探讨大 鼠肝脏缺血／再灌注 (I／R)损伤时血清 Leptin蛋 白及脂肪组织 LeptinmRNA 水平 的变化规律 ，报告如下 。 1 材料与方法 1．1 实验材料 ：雄性 SD大 鼠45只，体 注 ：P为预变性 ；D为变性 ；A 为退火 ；E为延伸 ；C为循环数 重 200 240g，由解放军总医院实验动 1．3 血清及脂肪组织样品制备：实验时 酶，5 lPCR 缓 冲液 (含 20mmol／L 物 中心提供 。”I标记物购 自Amersham 由心脏抽取血标本 。血样置于37℃水浴 MgC1)×10，灭菌去离子水 。口一actin反 公司 ，SephadexG一25葡聚糖凝胶 、焦 20min后 ，在 4℃下 3000r／min(离心 应体系上下游引物的量为 0．2 g，其余 碳酸二 乙酯 (DEPc)、琼脂糖、溴 乙啡啶 半径 15cm)离心 20min，吸取上层血 与 Leptin反应体系相 同。Leptin引物序 均购 自Sigma公司，鸟髓母细胞过多症 清 ，一2O℃下冻存待测 。抽血后迅速取 出 列参考 Jaworek等。介绍的方法 。PCR 病毒(AMV)逆转录酶、寡聚脱氧胸腺核 大 鼠左侧附睾体部脂肪垫 (属 白色脂肪 所需 的引物序 列及反 应条件见表 1。 苷酸 (Oligo(dT)l5]引物购 自Promega 组织 )，立 即投 入 液氮 速冻后 转 移 到 PCR产物于质量分数为 1．5 的琼脂糖 公 司 ，总 RNA抽提试剂 (Trizo1)、RNA 一 8O℃冻存 。 凝胶 (含0．5mg／L溴 乙啡啶)进行 电泳 酶抑制剂、水生嗜热 的脱氧核糖 核酸 1．4 放射免疫分析方法 ：设1．1×10 、 检 测 。以 Gel—pro软 件对 Leptin及 (TaqDNA)聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸 3．3×10 。、 11．0× 10一。、 33．0× 10 。、 口一actin的电泳条带进行灰度值分析 ，灰 (dNTPs)及 口一actin引物购 自北京鼎国 100．0×10 和 300．0×10 mg／L 6个 度 比值 为 同组标 本 Leptin灰 度 值 ／ 生物技术公司。Leptin引物 由上海生工 点，测量时加血清 100 l，将标准 品、样 口一actin灰度值 。 生物工程技术公司合成 。 品与100 l兔抗血清、100 l”I—Leptin 1．7 统计学方法 ：实验数据符合正态分 1．2 大鼠肝脏 I／R损伤模型建立 ：按随 混匀，4℃ 24h。加免疫分离剂500 l， 布、方差齐性 ，以均数 ±标准差 (z士 )表 机数字表法将大 鼠分为假手术组 (Sham 室温反应 15min，2830r／min(离心半径 示 ，采用 SPSS11．0统计分析软件进行 组)、肝脏缺血 60min再灌注 60min组 15cm)离心20min(4℃)，弃上清 ，测量 单 因素方差分析，组间比较采用 SNK (I60R60组 )、I60R15O组 、I60R240组 沉淀物 的计数值并绘制标准 曲线 。 法 ，PO．05为差异有统计学意义 。 和 I6