第二节实验材料与方法.pdf

ATP 與DnaK 結合。於是處於ATP 結合態的DnaK 便可以進入一個新的循環(Hartl, 1996)。 與DnaK 比較，基本上真核細胞裡hsc70 也和DnaJ 類似蛋白質(hsp40 或其 他DnaJ 類似蛋白質)合作(Cyr et al., 1994; Kelley, 1988)，但是與類似GrpE 核苷酸 交換無關。核苷酸交換不是真核細胞hsc70 循環反應的速率限制步驟(rate-limiting step)。hsc70 與作用的循環如圖五。 第二節 實驗材料與方法 一、質體的構築 (一)、引子(primer) hsc70 prmier (根據GenBank accession number:M11942) F541: 5’-TCGCTCGAGTCTTATGCG R646: 5’-AGGATCCTTAATCGACCTCTTC F388: 5’-GTTCAGGATTTGCTGCTCTTG R461: 5-CTCGAGCTACATGTACTTGTCGTGCTTG F132: 5’-AAGCTTGAAAGACTG 26 (二)、用於蛋白質表現的質體 pHSC70: 含有全長之hsc70 基因，構築於載體p56 中，用於在大腸桿菌中表現 hsc70。(Wang and Lee, 1993) pHSC70(R469C): R469C取代的hsc70構築於p56，用於大腸桿菌中表現 hsc70(L399P)和hsc70(R447G)。(Chang et al., 2001) pHSC70(L399P)、pHSC70(R447G):L399P或R447G取代的hsc70構築於p56，用於 大腸桿菌中表現hsc70(L399P)和hsc70(R447G)。以前本實驗室其他人用 dITP取代dATP作PCR (Spee et al.,1993)，以產生hsc70碳端30-kDa的突 變株，然後篩選出與CMLA(S-carboxy-α-lactalbumin)形成複合體的功 能有缺陷的突變株。篩選得到的各個突變株帶有不止一個胺基酸取 代。經由構築只帶單一胺基酸取代的突變株，發現其中兩株 30-kDa(L399P)和30-kDs(R447)無法和CMLA形成緊密結合的複合體 (蔡玉貞和王群，未發表)。為了構築hsc70(L399P)和hsc70(R447)的表現 質體，以F388和R461為引子，攜帶了30-kDa(L399P)和30-kDa(R447) 的質體為模版作PCR反應。接著用這兩種模版質體所產生包含了突變 點的PCR片段作為3端引子，F132作為5端引子，以pHSC70為模版， 作另一次PCR。然後以這PCR產物的Hind III到Sac I片片段取代 pHSC70-Ct的Hind III到Sac I片段。取代後的質體以Xho I和EcoR I切 開，接入pCt-10/R裡的Xho I – EcoR I片段。這最後獲得的質體稱為 27 pHSC70(L399P) 和pHSC70(R447G)。 二、 hsc70 突變株的純化 突變株hsc70(L399P)、hsc70(R447G)和hsc70(R469C)的純化步驟與hsc70 相 同，依照本實驗室以前的方法(Wang and Lee, 1993)，如第二章第二節所述。 三、天然洋膠電泳分析hsc70/CMLA 複合體 天然洋膠電泳是根據Laemmli (1970)的SDS方法，差別在天然洋膠電 泳的膠體和緩衝溶液不含SDS，如第二章第二節所述。 四、Lys-C 蛋白脢切割反應 我用蛋白脢Lys-C 切割蛋白質，探測hsc70 突變株的整體結構是否改變。 0.25 mg 蛋白質與 1 µg 的Lys-C 在緩衝溶液(75 mM KCl, 50 mM Tris,