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2017-09-02 发布于天津
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实验七大肠杆菌感受态细胞的制备.ppt

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实验七大肠杆菌感受态细胞的制备

* * 大肠杆菌感受态细胞的制备 1. 实验目的和要求通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2. 相关知识及原理感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 3．仪器、材料和试剂无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等；菌株：E.coli DH5α 质粒：重组质粒以及pUC19 空质粒； LB培养基；含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度50-100μg／mL，X-gal 20-48μg/ml, IPTG 100 μg/ml。一般将抗生素、X-gal和IPTG配制成1000?储备液，用时按培养基的量再加入）；预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） 4．操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法) （1）从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；