氟化物对骨形成中成骨细胞影响的实验分析.pdfVIP

中文摘要 目 的 我国是地方性氟中毒发生率较高的大国，出于氟的过量摄人导致的氟 骨症困扰了许多患者。目前人们对于氟的骨相损伤机制尚不完全清楚。成 骨细胞作为骨组织中重要的功能细胞，在骨的形成过程中起着关键作用。 本研究目的在于建立体外大鼠(乳鼠)颅骨成骨细胞分离培养体系及 鉴定技术，排除体内多种调控因素的相互影响，从单细胞的形态和代谢指标 的变化，观察氟化物对体外培养的成骨细胞的直接效应，探讨不同浓度氟化 物对成骨细胞是否具有促进增殖和分化作用，从而在细胞水平了解氟化物 对骨形成过程的作用；通过体内、外实验研究氟化物对成骨细胞结构、细胞 周期和细胞凋亡的影响，为进一步探讨氟致骨骼损伤的机制提供基础资料； 通过检测氟化物对成骨细胞的DNA损伤，探讨成骨细胞对氟化物的基因毒 性反应，为全面评价氟毒性提供科学依据。 方 法 1．大鼠颅骨成骨细胞分离培养纯化体系及鉴定技术的建立： 生后2天的Wistar乳鼠脱颈处死后，无菌取颅盖骨放入盛有缓冲液的 培养皿中，尽量去除骨膜和周围结缔组织。加入0．25％胰蛋白酶液，37。C 恒温消化20 min。再用lmg／111lⅡ型胶原酶溶液，37℃恒温消化90min，使 细胞从骨基质中解离出来。将上述含分离细胞及骨片的消化液移于离心管 中离心，去上清，加入含15％胎牛血清的199培养液，反复吹打成单细胞悬 液，以1 应用差速黏附法纯化成骨细胞。l型胶原免疫组化方法鉴定成骨细胞。 2．成骨细胞增殖、分化指标的测定 成骨细胞以5x 性磷酸酶活性。 3．成骨细胞周期和细胞凋亡的检测 成骨细胞以1 培养液中培养3天。换为无血清199培养液，24小时后加入终浓度为(0、 胞，PBS洗2次，加入配制好的PI染液37。C孵育30分钟，用流式细胞仪检 测细胞周期和细胞凋亡。 4．细胞DNA损伤检测 X 成骨细胞以I 105／ml接种于6孔板，待细胞融合后，换为元血清199 小时。经胰蛋白酶消化，离心弃上清，PBS冲洗2次，计数并调整使各剂量 组细胞悬液中细胞数为1．0×106／ml。用单细胞凝胶电泳(彗星实验)方法 检测DNA损伤。 5．动物实验 雌性Wistar大鼠40只随机分成4组：A组(对照组)大鼠饲正常饲料， 饮蒸馏水；B组饮用蒸馏水含氟化钠50mg／L；C组饮用蒸馏水含氟化钠 部雌鼠与20只雄鼠按2：1进行交配。所生仔鼠颅盖骨进行光镜、电镜观 察；提取仔鼠颅骨成骨细胞，观察细胞超微结构，检测细胞周期与细胞凋亡 的变化。 6．数据处理 用EXCEL、SPSSl0．0进行实验数据的统计分析。 结 果 1．原代成骨细胞培养结果： (1)相差显微镜观察 分离的成骨细胞在培养24h后，活细胞贴壁生长。贴壁生长的细胞呈 梭形、三角形或多角形等。成骨细胞在单层铺满培养瓶后可出现重叠生长， 其中心部细胞密集并可发生钙化，形成肉眼可见的散在白色点状物。 (2)I型胶原免疫组化鉴定 ·2· 成骨细胞的胞浆内和细胞间质中分布有棕黄色颗粒，为成骨细胞所分 泌的I型胶原，胞核空染，为阳性结果。 2．不同浓度的氟化钠对成骨细胞增殖、分化的影响 活力。 3．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞细胞周期和细胞凋亡的影响 胞明显减少。NaF浓度为2、3、4mmol／L时，凋亡百分率增高。 4．不同浓度的氟化钠对体外培养成骨细胞DNA的损伤作用 相比也有显著性差异。 5．母鼠体内不同程度染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的影响 5．1母鼠染氟对所生仔鼠颅骨成骨细胞的超微结构的影响 对照组可见OB线粒体、内质网清晰正常，细胞核形状规整，细胞表面 毛消失；线粒体清晰，部分出现嵴断裂或消失，有时出现空泡；粗面内质网轻 度扩张。雌鼠染NaF100mg／L时，胞浆空泡增多，粗面内质网轻度扩张，部 分线粒体嵴断裂或消失；核不规整，核染色质致密、浓染，彼此分离，凝集核 膜周边，出现凋亡早期形态一染色质边集。雌鼠染NaF