1核酸杂交.PPT

核 酸 杂 交 目的与要求 了解核酸探针的概念、种类及选择原则 了解核酸探针的标记和检测方法 了解常用核酸杂交的方法及应用 核酸分子杂交 核酸分子杂交的基础：分子单链之间的互补碱基通过非共价键（主要是氢键）的形成即出现稳定的双链区。 杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补。 分子杂交可在DNA与DNA、RNA与RNA或RNA与DNA的二条单链之间进行。 DNA与DNA杂交：一般DNA以双链存在，在进行杂交时，先将其解聚成为单链（变性）。再退火使单链聚合成双链。 定性或定量分析分子杂交：将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行分子杂交。 核酸分子杂交的发展 液相杂交：Hall等1961年将探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确，但它开拓了核酸杂交技术的研究。 固相杂交： Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。 膜杂交：60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA或RNA探针检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的DNA序列奠定了基础。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。 原位杂交：Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位。 核酸分子杂交的技术要素 核酸探针的制备 核酸探针的标记 核酸标记探针的检测 核酸分子杂交的技术方法 探 针 探针：带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子结合。 核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同，通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结合。 核苷酸经某一原子、功能基团或侧链修饰后仍可能进行碱基配对。能与核酸结合的单一原子有银、溴和碘等。 放射性同位素32P和35S标记核酸时，是掺入核酸骨架的磷酸二脂键中，因此碱基未发生任何修饰。 在5’端的磷酸基团上也可进行化学修饰。 核酸探针的种类 根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类； 根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类； DNA探针还有单链和双链之分。 DNA 探针 DNA探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列。这些DNA片段须是特异的。 探针制备 建立细菌基因组DNA文库，获得细菌特异的核酸探针。 建DNA表达文库，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段 DNA探针的优点 ①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。 ②DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。 ③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记 cDNA探针 cDNA（complementary DNA）是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经逆转录酶（reverse transcriptase）的DNA聚合酶催化产生的，这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故称反向转录或逆转录。 制备方法：RT-PCR RNA探针 RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。 反义RNA探针 通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的转录方向，即以哪条DNA链以模板转录RNA。 这种可以得到同义RNA探针（与mRNA同序列）和反义RNA探针（与mRNA互补），反义RNA又称cRNA，除可用于反义核酸研究外，还可用于检测mRNA的表达水平。 因为探针和靶序列均为单链，所以杂交的效率要比DNA-DNA杂交高几个数量级。RNA探针除可用于检测DNA和mRNA外，还有一个重要用途，在研究基因表达时，常常需要观察该基因的转录状况。 克隆探针的特点 前述三种探针均是可克隆的，其优点：在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，因为克隆探针较寡