真空冷冻干燥保存兔角膜内皮细胞的光电镜酶组织化学实验分析.pdfVIP

中文攘要 前 言 真空冷冻予燥保存法(VFDP)保存角膜技术是在深低温冷冻 保存法程脱水予燥保存法基愁上建立起来的。它是将离体的焦膜 组织经过深低瀑冷冻使组织痰的水分凝结成固态，然詹在真空条 l牛下使固态的永升华。评价保存效果的关键是对角膜内皮细胞滔 性的检测。角膜蠹皮细胞活性可反映在内皮缨胞的酶活性上。利 用光镜、电镜酶组织化学方法霹测定兔角膜蠹皮细胞酶活性。本 实验研究旨在透过光镜、奄镜酶终织化学方法对凉千保存晦兔惫 膜杰皮缨耱的三磷酸滕苷酶(ATPase)及琥建酸脱氢蘸(SDH)进 行检测，从而判定真空冷冻干燥保存法(冻于法对于兔角膜内皮 细胞活性的影响。 ／材料鞫方法 1实验设备及试剂 真空冷冻干燥视(东北大学制造) =甲基翌戳、柠檬酸铅、蹬唑氮蓝、琥珀酸铺、左旋殊矬等：美 国SlG醅A化学试剂有限公司。 ． 20％入崮蛋自：上海菜士巍翻品有限公蠲。 简易降温仪(鸯铡) 2动物来源及分组 成年大耸自兔，2．5～3．0kg，18灵 根据随机原则及配对原则将36只兔眼分为3组，每组12只， 分别为冻干实验组、冷冻对照组和新鲜对照组。 -1， 3基本操作 3．1配嗣冷冻保护液： 二甲基旺砜(DMSO)浓度(V／V)为5％、10％，与∞％入自蛋 白配制成2．5mt的保护液。 3．2箭备兔角膜片： 铷俸出～个带2—3mm巩膜环的角膜片。 3．3配锏复永液： 1640加20％兔血清 3．4深低温冷冻保存兔角膜： 4℃条件下将角膜片依次放入l号液、2号液巾各平衡∞ min；梯度降温；液氮内保存； 3．5真空冷冻千燥保存兔角膜： 冷冻前处理及梯度降温阊深低温冷冻法。冻干枕内冻干，充 氮封盖。室温或冰箱保存。 3．6冷冻角膜的复温 3．7冻千角膜的复水 4光镜酶组织化学方法 4．1Na+一K+三磷酸腺苷酶(Na+一K+一ATPase)显示法 新鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻干复水角膜片标记，固定，漂 洗，置于ATPase孵育液内孵育60rain，反应后的处理，明胶封片， 光镜观察，为细胞膜上的棕色颗粒 4．2琥珀酸脱氢酶(SDH)显示法 颏鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻干复水角膜片置于SDH孵 肖液内孵育，屠固定，漂洗，甘油明胶封片，光镜观察。为胞浆内的 蓝色颗粒。 5电镜酶组织化学方法 孵育的组织黯固定，漂洗，梯度脱水，Epon812包埋，制作超薄 切片，醋酸铀染色透射电镜下观察，拍片。 ·2· 6统计学分析： 应用Metamorph图象采集系统，测定角膜酶染色讶片的积分 光密度鳘，应用SPSSl1．0软件对数据进行统计学处淫。 实验结果 1光镜酶组仡的观察结果 ATPase和SDH新鲜角膜、冷冻角膜、冻干角貘均呈雨往反 应。实验组与对照缀裙眈，颜色较浅，平均积分光密度值较低，差 异具有统计学意义(P0．01) 2电镜酶组化的观察结果 ATPase新鲜角膜、冻予角膜上可觅细臆膜连续完整，有黑色 的ATP酶颗粒均匀沉着于缅胞膜上。冷冻角膜见细胞膜不连续， 黑色的酶颗粒存在予缅胞膜上及细胞内。 SDH三缀标本均为内旋细胞层脱落，未能观察劐结果。 讨 论 角膜的冻干保存法是在深低游冷冻保存法及干燥保存法的基 础上建立起来的。冻干的角膜片可以在冰箱及室温下保存，运送 方便，成本较低，值得研究。冻千法保存角膜的过程包括深低溺冷 冻阶段和干燥阶段。首先，对离体的兔角膜片进行深低温冷冻。 将冷冻后的角膜片迅速移至真空冷冻干燥机的干燥室内。利用控 制其真空度的方法使角膜组织内固态的水升华。使用时在适当的 条件下复水，使干燥的组织尽可能恢复其原有的生理状态。 角膜内皮细胞存在着多种酶，其中活性较高的为琥珀酸脱氢 酶、苹果酸脱氯酶，ATP酶，酸性磷酸酶等。这些酶均参与细胞内 的组织代谢过程。应用酶组织化学法测定内皮细胞的