纤维素结合域的酿酒酵母表面展示及其黏附位点初探 - 浙江大学奶业 .pdfVIP

动物营养学报２０１１，２３（６）：９７６９８２ ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｉｍａｌＮｕｔｒｉｔｉｏｎ 　 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００６２６７ｘ．２０１１．０６．０１４ 纤维素结合域的酿酒酵母表面展示 及其黏附位点初探  张玉杰　王佳 　叶均安　刘建新 （浙江大学奶业科学研究所，杭州 ３１００２９） 摘　要：利用酿酒酵母表面展示系统表达产琥珀酸丝状杆菌 Ｓ８５纤维素结合域家族 ２ （ＣＢＤ２），分析其纤维黏附位点。将ＣＢＤ２基因插入质粒ｐＹＤ１的ＡＧＡ２３′端，构建ｐＭＣＢＤ２重 组质粒，化学转化ｐＭＣＢＤ２至酿酒酵母 ＥＢＹ１００中，２％半乳糖诱导 ＣＢＤ２表达于酿酒酵母表 面。利用免疫组化技术检测重组酵母细胞在稻草茎细胞壁上的黏附位点。结果表明：利用酿酒 酵母表面展示系统可成功表达产琥珀酸丝状杆菌Ｓ８５的ＣＢＤ２基因；重组ＣＢＤ２的ｐＭＣＢＤ２ ＥＢＹ１００与稻草茎孵育后，经抗Ｖ５异硫氰酸荧光素标记抗体处理可在稻草茎的薄壁、厚壁和维 管组织均检测到荧光。产琥珀酸丝状杆菌Ｓ８５的ＣＢＤ２黏附稻草多个组织。结果提示：酿酒酵 母表面展示技术与免疫组化技术联用研究瘤胃细菌ＣＢＤ的黏附位点是可行的。 关键词：纤维素结合域；酵母表面展示系统；黏附位点；产琥珀酸丝状杆菌 中图分类号：Ｓ８５２．６　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００６２６７Ｘ（２０１１）０６０９７６０７ 　　反刍动物通过瘤胃微生物发酵纤维素、半纤 都具有 ＣＢＤ２结构域，突显了 ＣＢＤ２的重要性。 维素等结构性碳水化合物满足机体的能量需要。 ＣＢＤ是高度折叠的氨基酸序列，传统的研究方法 瘤胃微生物对纤维物质的黏附是降解纤维的首要 难以应用于其研究。酵母表面展示技术是近年来 条件［１－２］。因此，微生物对纤维物质的黏附一直是 发展较快的一种真核蛋白表达系统，其基本原理 反刍动物营养研究的热点之一。微生物对纤维物 是将外源靶蛋白基因与特定的载体基因序列融合 质的黏附包括非特异性黏附和特异性黏附２种形 后导入酵母细胞，利用酵母细胞内蛋白转运系统 式，特异性黏附又以酶的纤维素结合域（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ 转运到膜表面，从而使靶蛋白固定化表达在酵母 ［３］ 细胞表面［１２－１３］ ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）研究得相对深入 。ＣＢＤ 。酿酒酵母对表达蛋白翻译后修 ［１３］ 是碳水化合物活性酶内具有纤维素结合能力的高 饰加工，易于培养、传代稳定 ，在研究ＣＢＤ的过 度折叠的一段氨基酸序列，目前的研究致力于 程中无需分离、纯化操作，而且表达的蛋白可通过 ＣＢＤ的应用［４－７］、蛋白质和碳水化合物结合机 特异性免疫组化进行灵敏而方便地检测和筛选。 ［８］ 制 等，较少涉及瘤胃优势纤维分解细菌。产琥 为此，本试验利用酿酒酵母展示技术展示产琥珀 珀酸丝状杆菌（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）是瘤胃内 酸丝状杆菌的ＣＢＤ２，并通过特异性免疫组化反应 主要的三大纤维分解细菌之一［９－１１］。ＣＡｚｙ（ｈｔ 分析ＣＢＤ２纤维物质的黏附位点，探讨其重要性， ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）数据库显示，产琥珀酸丝状 为后续深入研究 ＣＢＤ与瘤胃细菌特异性纤维黏 杆菌Ｓ８５的ＣＢＤ分属于家族２、６、１１和３０，而这４ 附位点的关系研究奠定基础。 个家族在微生物中的分布并不均衡，很多细菌酶 收稿日期：２０１１－０１－０８ 基金项目：国家自然科学基金 作者简介：张玉杰（