慢性乙型肝炎患者外周血中乙肝病毒表面抗原低水平发生机制的研究 .doc

慢性乙型肝炎患者外周血中乙肝病毒表面抗原低水平发生机制的研究 郭红英 张继明 李新艳 毛日成 翁心华 复旦大学附属华山医院传染病科，华山医院肝病中心 200040 [摘要] 目的　慢性乙型肝炎患者外周血中乙型肝炎病毒（HBV）的表面抗原（HBsAg）滴度通常较高，长期临床观察发现少部分慢性乙型肝炎患者病毒滴度低于250国际单位每毫升(IU/ml)，本文探讨此类患者外周血中乙肝病毒表面抗原低水平的发生机制。方法　HBsAg滴度以美国雅培公司ARCHITECTi2000SR仪器检测值为标准，收集低于250IU/ml患者的血清，抽提血清中的HBV-DNA,并对HBV　S区进行PCR扩增及测序。对于出现特殊变异位点的血清标本，进行全基因扩增并测序，从而得到血清HBV全基因序列。将每例标本的全基因扩增产物进行克隆，从中随机挑选15-20个单克隆，对每个单克隆的S区进行测序及序列分析，将单克隆S区序列与血清HBV全基因序列进行比对，挑选出与血清HBV全基因序列同源性最高的克隆，即优势株。将挑选出优势株的小S蛋白（S-HBsAg）基因克隆至pXF3H真核表达载体在HBsAg的端HA标签蛋白。将该表达载体转染至Huh7及Hela细胞内，用ARCHITECT HBsAg QT方法检测上清中的HBsAg。用针对HA的抗体进行免疫印迹实验，来检测含HA标签蛋白的HBsAg表达量。结果　分析16例低表面抗原水平患者的S区氨基酸发先有15例患者发生了某些位点变异,其中报道较多的位点有：T120T，T/I126N，Q129N，G130R，T131N，M133T。报道较少的位点为：N40S，I68T，C76Y，L95W，V96G，L98V，S117T，A157D，W196L，F220L。发现S6号患者S-HBsAg区的启动子（nt2976-3174）缺失，其15个亚克隆此区域均缺失。S15号患者S-HBsAg第22位氨基酸出现终止密码子，分析其9个亚克隆的S-HBsAg氨基酸发现有3个第22位氨基酸出现终止密码子，3个第31位氨基酸出现终止密码子，3个氨基酸序列与野毒株完全相同。分析其亚克隆的氨基酸序列发现：一些亚克隆出现了一些优势株未出现的影响HBsAg抗原性的变异位点。如：K122R，S132F，F134L，P142H，C149R；另外一些影响分泌的变异位点：C48Y，L77Q，R78Q，R79H，C107R的变异及69位半胱氨酸的缺失。将S6号（含有Q129/N变异位点）和S2号（含有T/I126N及T131N变异位点）的优势株小S基因的PXF3H质粒转染细胞后，上清中HBsAg的水平较野毒株水平低2-4倍，但上清中用针对HA抗体进行免疫印迹实验检测，发现含HA蛋白标签的变异株(mtHBsAg)的表达量较野毒株（wtHBsAg）增加，其糖基化的S-HBsAg的量更是明显增多。同样抗体免疫印迹实验检测细胞裂解液中含HA蛋白标签的S-HBsAg表达量具有同样发现。mtHBsAg用针对S-HBsAg多克隆抗体进行免疫印迹实验，结果为阴性。结论 小S区氨基酸某些位点的变异（优势株和非优势株）是慢性乙型肝炎患者外周血中乙型肝炎病毒低表面抗原水平的因素之一，小S基因的启动子缺失和S区氨基酸在抗原表位前已经出现终止密码子也是因素之一。另外某些小S区的氨基酸位点变异为天门冬酰胺asparagine，即N）后，其糖基化的S-HBsAg水平即升高，S-HBsAg过度糖基化将影响其空间构型进而影响其抗原性，影响了其检测水平。总之，多种因素导致了某些慢性乙型肝炎患者外周血中低HBsAg的水平。 [关键词] ] 乙型肝炎病毒；低表面抗原水平；全基因扩增；转染，免疫印迹 作者单位：200040，复旦大学附属华山医院传染科（郭红英、李新艳、张继明、毛日成、翁心华）； 通讯作者：张继明，E-mail: jmzhang@fudan.edu.cn  The mechanism of low HBsAg titer in chronic hepatitis B patients GUO Hong-ying , ZHANG Ji-Ming *,et al. Department of Infectious Diseases, Huashan Hospital, Fudan University; Shanghai; 200040, China *correspondence author: ZHANG Ji-Ming, email: jmzhang@fudan.edu.cn Objective：possessing high HBV-DNA level in this study. Methods: Hepatitis B virus (HBV) DNA was extract