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第二部分 DNA 产物纯化和凝胶回收 分子生物学实验中经常用到基因克隆及载体构建，而 PCR 和酶切是基因克隆最常用到 的技术，在 PCR 反应中有模板、引物、酶及其他盐类等物质参与，酶切实验中也往往涉及 内切酶、其他蛋白及盐类等，这些杂质对后续的实验一般具有较大的影响，因此，必须对目 的DNA 产物进行纯化。纯化的方式有直接纯化与切胶纯化，具体运用哪种纯化方法要视具 体情况而定。 DNA 产物纯化试剂盒：适用于酶切或 PCR 产物中只有一条 DNA 片段或所有的片段都 需要回收，这种试剂盒属于直接纯化，不需要凝胶电泳，直接对反应产物进行纯化回收。 琼脂糖凝胶回收试剂盒：最常用、适用于绝大多数的 DNA 纯化实验，可从多条 DNA 片段中纯化其中一条或几条。这种试剂盒属于切胶纯化，需要凝胶电泳，如测序或构建载体， 就要对目的条带采取该方法处理。 通用型 DNA 纯化回收试剂盒：既可以对凝胶溶解纯化，又可以直接对溶液纯化。 本公司生产的 DNA 纯化回收试剂盒采用可与核酸特异吸附的硅胶膜，通过在低 pH 和 高盐缓冲液中结合 DNA ，在高pH 值和低盐缓冲液或水中洗脱 DNA 的原理，达到纯化DNA 产物的目的，同时去除各种蛋白质、无机盐和有机物杂质等。 DNA 片段回收与纯化技术简介 质粒、噬菌体等经酶切、电泳，PCR 产物或 PCR 产物经电泳后，常常需要对其中一些 DNA 片段进行回收和纯化，以用于克隆、测序或探针标记等实验。经典 DNA 回收和纯化 常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，由于这些方法操作复杂，回收率偏低等缺 点，很少有人再用。凝胶溶解系统的改进，硅胶吸附膜的利用，使 DNA 片段回收纯化变得 更为容易，目前市场上销售的纯化回收试剂盒大都采用离心柱与硅胶膜结合的模式，以这种 方法纯化回收，操作简便，用时短，回收效率高。 DNA 片段纯化与回收试剂盒的工作原理 在获得 DNA 片段后，采用吸附材料与之结合，通过漂洗液的清洗去除杂质，用水或洗 脱液回收。目前大多数生物公司都采用硅胶膜作为吸附介质，可以特异地吸附 DNA 片段， 有效去除体系中的蛋白、盐类和有机物质。 DNA 片段纯化与回收的种类 根据 DNA 片段在待回收体系中是否为单一条带，可将 DNA 片段的回收分为两大类： 直接纯化和切胶纯化。 直接纯化 适用于有单一 DNA 片段或溶液中所有的 DNA 片段都需要回收的情况。一些下游实验 如测序、SNP （single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）分析等，需要从PCR 或 酶切产物中去除盐离子、dNTP、蛋白、多余引物等杂质，因为这些成分会抑制后续试验的 酶活性。采用硅基质材料来吸附 DNA ，既能达到纯化 DNA 的目的，又能简化整个实验进 程。当我们把扩增后的 PCR 溶液加到硅基质膜上时，目的片段就会特异地结合上去，而其 他如 dNTP，引物二聚体、非特异性片段等杂质会被过滤掉，通过后面的漂洗步骤可进一步 去除多余的杂质，最后用水或洗脱缓冲液就可以把 DNA 片段洗脱下来，达到纯化 DNA 的 目的。 切胶纯化 适用于选择性回收溶液中多种 DNA 片段中的一种。对于后续的实验采用切胶纯化则是 最为有效的方法。通过琼脂糖凝胶电泳可以分开特异性和非特异性条带，在紫外光照射下， 快速、有效地切下目的 DNA 片段所在位置的凝胶，然后通过进一步的纯化就可以得到目的 片段。对于要求较高的后续实验，建议采用切胶纯化的方法，这样得到的片段较直接纯化的 纯度会更高一些。 本公司针对以上两种纯化方法开发出了 DNA 产物纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒，可以 满足不同的实验需求。另外，本公司研制的通用型 DNA 纯化回收试剂盒，更是兼容了两种 回收方式的优点，极大地方便了用户，使您购买一种产品就能完成两种不同的实验。 DNA 片段回收纯化的一般流程 反应液收集 1．PCR 反应液 1）如要进行后续 TA 克隆，请选用能在扩增产物末端加 A 尾的聚合酶，如 Taq 酶或 Hotstart Taq 热启动酶。 2）如对扩增序列保真度要求高，请选用具高保真扩增能力的聚合酶，如 Pfu 酶。 3）由 Pfu 酶扩增得到的 PCR 产物