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tn42 高效阴离子交换色谱分析糖蛋白类低聚糖
TN42 高效阴离子交换色谱分析糖蛋白类低聚糖
前言
再生体衍生糖蛋白类在治疗剂应用方面的发展导致了表征碳水化合物结构方法的需求
增长。高效阴离子交换色谱与脉冲安培检测(HPAE-PAD )技术可以直接快速的定量未衍生
的碳水化合物样品,所以在表征其结构方面被广泛应用。HPAE-PAD 可以根据所带的电荷分
离低聚糖,而且还可以根据糖的大小、组成和单糖单元的连接来分离带相同电荷的低聚糖。
低聚糖可以通过与标准的共淋洗或通过保留时间的比较来进行表征。HPAE-PAD 方法中
低聚糖结构之间的经验关系和色谱保留在前面已有描述[1]。HPAE-PAD 分离得到的低聚糖
通常在柱后收集而后用质谱和 NMR 作进一步的结构分析。
在药物和生物技术工业中,HPAE-PAD 技术在糖蛋白类碳水化合物结构方面的应用包
括:1),在初始表征时用来分离和鉴别存在的低聚糖结构;2 ),监测糖基化的一致性,鉴别
细胞培养条件或生产过程改变引起的糖的变化;3 ),监测不同的细胞系表达引起的糖基化变
化。附录中列出了 HPAE-PAD 在糖蛋白类谱中的应用文章。
本技术注解描述了 HPAE-PAD 方法应用于一家生物技术公司质量控制测定 N -牛胎球
蛋白低聚糖方法的准确度、精密度、线性和检测限。这些结果可以为 HPAE-PAD 绘制低聚
糖谱的方法验证提供指导。
实验部分
Dionex DX-500 系统包括:LC30 柱温箱;GP40 梯度泵,有在线脱气装置;ED40 电化
学检测器,金电极;AS3500 自动进样器或8880 自动进样器;PeakNet 色谱工作站
试剂与标准
去离子水,色谱级;50% (w/w )氢氧化钠(Fisher Scientific );胎球蛋白低聚糖糖醇标
准(Dionex ,P/N43064 );脱唾液酸和二唾液酸半乳糖化双触角低聚糖标准(Oxford
GlycoSciences )
条件
柱子:CarboPac PA-100 分析柱(4×250mm ),带保护柱
检测:ED40 电化学检测器,金电极
进样体积:10μL
波形:碳水化合物波形(参见 TN21 )
淋洗液:A :100mM NaOH;B :100mM NaOH/0.5M NaAc
流速:1mL/min
1
方法:
时间(min ) %A %B
初始 99 1
0.0 99 1
0.2 99 1
10 90 10
50 55 45
50.1 0 100
55 0 100
55.1 99 1
70 99 1
本分离方法中的初始条件包括 1%B,是为了防止柱子从氢氧化钠换成醋酸钠淋洗液时
偶尔产生的基线干扰。这个方法是在一家生物技术公司的质量控制实验室开发的。我们相信,
如果淋洗液 A 由 100mM 氢氧化钠换成 100mM 氢氧化钠/5mMNaAc ,并且把应用 99%A 和
1%B 的时间全部换成 100%A,这个方法的重复性会更好。
本方法应用的金电极是一个旧电极且近段时间没有打磨。
梯度优化
前面所述梯度可以有效的分离唾液酸胎球蛋白低聚糖糖醇。因为 HPA
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