荧光标记mrna 差异显示技术mrna 差异显示技术 - 中国试剂网.pdfVIP

中国试剂网 3.14.1.9 荧光标记mRNA 差异显示技术 mRNA 差异显示技术 （differential display，DD ）是用于研究基因的差异表达的 新方法。该技术自1992 年被首次报道后，即以其不可替代的优势被广泛应用于 生物医学领域。在应用过程中不断得到改进，并产生了诸多衍生技术如RPA（RNA fingerprintingbyarbitrarilyprimedPCR ）、GDD （genomicDD ）等。本文简要介 绍在本试验室荧光标记差异显示技术 （fluorescentDD，FDD ）的应用及体会。 1.材料与方法 1.1 标本 人单核细胞系U937 ，细胞密度2×108/L，分对照组 （N ）、处理Ⅰ组（T1 ）、处理 Ⅱ组（T2 ），N 用1640 培养基及10%胎牛血清培养，T1 用IFNγ104U/LLPS1g/L、 T2 用IFNγ10U/LLPSl0g/L 分别刺激7h. 1.2 主要试剂与仪器 TRIzol 试剂 （GIBCOBRL ）、FluoroDD 试剂盒 （Genomyx ）、Supersript Ⅱ逆转 录酶（GIBCO BRL ）、AmpliTaqDNA 聚合酶（GIBCOBRL ）、RNasefreeDNaseI （Promega ）；GenomyxLR 、 GenomyxSC 、DNAThermalCycler （PerkinElmer ） 1.3 总RNA 的制备 按试剂盒提供的方法分别提取三种细胞的总 RNA, 以 RNasefreeDNaseI （终浓 度80000U/L）除去其中污染的 DNA,经甲醛变性凝胶电冰鉴定其完整性，并以 紫外分光光度计检 测其纯度 1.4mRNA 差异显示 1.4.1 逆转录反应 选择锚定引物 [T7 （dT12 ）AP(anchored prime rs ，AP)] ，序列为 5ACGACTCACTATAGGGCTTTTTTTTTTTTMN3 ，其中 M=A/G/C 。N=A /G/C/T], 以总RNA 为模板进行逆转录反应，每管反应体系如下：总RNAl.0g， AP4pmol ，70℃ 5min ，加入50mmol/LTrisHCl （pH8.3 ），75mmol/LKCl，3 mmol/LMgCl2 ，10mmol/LDTT，25mol/L，dNTPmix （1 ∶1 ∶1 ∶1），SuperScript Ⅱ 60Units ，总反应体系20l ，42 ℃ 5min ，50℃ 50min ，70℃ 15min 。 1.4.2 荧光标记差异显示PCR 中国试剂网 3.14.1.9 选取与逆转录引物序列相同的带荧光物 质标记的锚定引物[TMRT7(dT12)AP]， 随机引物（5ACAATTTCACACAGGAACGCTAGTTG3 ），以逆转录产物为模板， 进行PCR 反应。反应体系包括：20mmol/LTrisHCl （pH8.4 ），50mmol/LKCl,3.75 mmol/LMgCl2 ，逆转录产物3.0l，50mol/LdNTPmix （1 ∶1 ∶1），0.35mol/L 5随机引物，0.35mol/L3锚定引物，AmpliTaq0.5Units ，总反应体系10l。 反应步骤如下：95℃ 2min ；94℃ 15s ，50℃ 30s ，72℃ 2min ，4 个循环； 94 ℃ 15s ，60℃ 30s ，72℃ 2min ，个循环；72℃延伸7min 。 1.4.3 分离差异显示片段 配制5.6%变性聚丙烯酰胺凝胶，胶厚0.25mm，大小61×33cm 。将PCR 产物加 4.0l 上样缓冲液，95℃变性后上样。3000V、100W 、55℃电泳4.5 h 。干胶后 置于GenomyxSC 扫描，用系统所带的AcquireSCprogram 软件分 析处理扫描结 果。 1.4.4 回收差异条带 用 AcquireSC 软件将差异条带定位，用一