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2013-08-10 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：超滤和透析纯化Cry2Ab蛋白 试验人员：许炼 试验负责：朱育菁、潘志针 报告日期：2013-08-10 计数月份：2013年月 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591试验目的 超滤技术是一种以超滤膜作为分离介质，以膜两侧的压力差为驱动力，利用料液中各组分在高分子膜中传质的差异，对其进行分离、分级、纯化和浓缩的方法。在超滤过程中，所用超滤膜的孔径约为1-100 nm，截留相对分子质量( molecular weight cutoff，MWCO) 为3×105-1×106，能用于蛋白质、细菌、胶体、病毒、热原、多糖等的分离[1]。 Chay Pak Ting等[2]分别利用MWCO为1×104和3×104的PES膜，在操作压力0.14 MPa、料液PH为8.0及温度为50℃的条件下，对卵高磷蛋白(Mr=3.5×104)进行浓缩和脱盐，结果，目的蛋白分别浓缩了6.25和5.92倍，其粗提物得率分别为84.7%和84.4%。 透析是利用小分子能通过而大分子不能通过半透膜的原理把它们分开的一种重要手段。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。商品透析袋制成管状，其扁平宽度为8mm77mm不等。为防干裂，出厂时都用10的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须通过活化除去。 试验方法 经过NTA-Ni纯化后的Cry2Ab蛋白。 APS(电泳级)、TEMED（电泳级）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠购自国药集团化学有限公司；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺 PowerPac垂直电泳仪（BIORAD），Centrifuge 5418R（Eppendorf）。 超滤、透析缓冲液 （PH=7.8） Na2HPO4 8mM KH2PO4 2mM NaCL 150mM 2.2.1 超滤纯化Cry2Ab蛋白 (1)新买来的超滤，使用前加入超纯水，水完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。 (2)浓缩到剩下1ml时，取10ul流穿，检测是否含有蛋白，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤（要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测）；继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。 (3)前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。 (4)取出最终蛋白浓缩液（冰上操作），用黄枪头轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取 浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。 (5)倒出超滤管里的水，用超纯水轻轻润洗几次，加入0.2M/L的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入超纯水的烧杯，放置几个小时，再换新的水，放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。取出浸没的管芯，加至接近满的超纯水，50ml离心管也加满超纯水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。 Cry2Ab蛋白 透析袋的活化 Cry2Ab蛋白透析 2.2.3 SDS检测浓缩胶和分离胶的配方如下： 浓缩胶 去离子水 1.9mL 30%Acr-Bis