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Ni-NTA 纯化树脂(Ni-NTA Resin) His 标 Cat.No.: C0401 Size: 20 ml(50%浆料) Cat.No 描述：Ni-NTA Resin 是用于纯化6×His 标签重组蛋白的一种 Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl,10% Glycerol)和1 mM PMSF。 纯化介质，它是由4%交联的Sepharose 耦连了一种四齿螯 注意：PMSF 见水分解，需要在使用前加入。 合剂NTA 而得. 它可用于在非变性或变性条件下纯化任何 3) 将细胞悬浮起来，超声或匀浆破碎细胞。该步骤冰上操 表达系统表达的6×His 标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合 作。 区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+ 。6×His 可与Ni2+ 4) 加入10% Triton X-100, 使终浓度为0.05%，充分混匀， 螯合，从而使His 标签蛋白结合在Ni-NTA 纯化介质上，未 冰上放置15 分钟。 结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度 5) 13,000 转/分(20,000xg 以上)，4°C 离心15min。取上清， 的咪唑或低PH 缓冲液被温和的洗脱下来，从而得到高纯度 置于冰上备用或-20°C 保存。 的目的蛋白。 2. 层析 1) 将NTA 树脂装入合适的层析柱，层析用10 倍NTA 体积 主要特征 的NTA-0 Buffer 平衡填料。 ♦ 该纯化介质与His 标签蛋白具有极高的亲和力，可达 2) 将上清样品加至NTA 层析柱中，流速在 15 ml/h 左右， 5-20 mg/ml 。 收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白质的结合情况。 ♦ 可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His 3) 层析用5 倍NTA 体积的NTA-0 Buffer 洗涤填料，流速控 标签蛋白。 制在30 ml/h 左右。 ♦ 纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95 ％。 4) 再分别用5 倍NTA 体积的NTA-20、NTA-50、NTA-100、 ♦ Ni-NTA 可再生4-6 次，重复使用。 NTA-250 洗脱填料，流速控制在15 ml/h 左右，收集洗脱液， 每管收集一个NTA 体积。 组成：50 ％的悬浮液（20 ％乙醇），已螯合Ni2+ 。 5) 确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。最为有效的方 式是SDS/PAGE 分析。也可以用Bradford 蛋白质测定试剂 应用 盒，快速确定蛋白质的含量，然后用 SDS/PAGE 分析蛋白 ♦ His 标签蛋白的纯化。 质的分布。 ♦ 蛋白结构与功能研究。 6) 目标蛋白质需要进一步纯化需要根据蛋白质的用途确 ♦ 蛋白-蛋白以及蛋白-DNA 之间相互作用的研究。 定。纯化的目标蛋白质的保存条件需要根据蛋白质的性质和 ♦ 配体-受体之间相互作用的研究。 用途确定。 储存：4 ℃保存，可保存2 年。 3. 溶液配方