EK-人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达_杜广营.pdf

( ) 第 2 1卷第 1期 烟台大学学报 自然科学与工程版 Vo l. 2 1 No. 1 2008年 1月 Jou rnal of Yantai U n iversity (N atural Science and Engineering Edition) J an. 2008 　　文章编号 :(2008) 0 1004006 人肠激酶轻链基因的克隆及其 在大肠杆菌中的表达 杜广营 (烟台大学 药学院 , 山东 烟台 264005) 摘 　要 : 研究目的:克隆表达人肠激酶轻链编码基因 , 以期应用于融合蛋白的切割与纯 化. 方法 :从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的 5个外显子基因片段 ,经过酶切 、 连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列 ;随后 ,将 目的基因片段插入原核表达 载体 pBV220 中 ,构建成融合型表达载体 pBV - EK ,转化大肠杆菌 BL2 1 (D E3) ,调节温度 L 至 42 ℃诱导重组蛋白表达 ;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白. 结果 :所表达的重组蛋白 经 SD S- PA GE分析 ,相对表观分子质量约为 3 1 kD a,表达量占菌体总可溶蛋白量的 46% ; 通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性. 结论 :成功构建 了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株 ,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在 生产和医学方面的应用研究奠定了基础. 关键词 : 人肠激酶轻链 ; pBV220;基因工程 ;原核表达 中图分类号 : Q78　　　　文献标识码 : A 　　基因工程生产过程中 ,很多 目的蛋白采用融 肠激酶轻链的相关研究报道 [ 7 ] ,但未见关于人肠 合表达的方式. 融合蛋白中的融合片段会影响 目 激酶轻链的相关基因工程方面研究报告. 关于重 的蛋白的生物功能. 早期采用化学裂解法除去融 组牛肠激酶轻链的研究已经比较充分 ,但 目的主 合片段 ,虽便宜有效 ,但由于裂解位点的特异性低 要是集中在用于切割重组蛋白. 本研究通过基因 和可能对 目的蛋白产生不必要修饰 ,现在逐渐被 ( 工程手段生产人肠激酶轻链 hum an en terok ina se 酶解法取代. 酶解法中 , 以肠激酶的应用较广泛. ligh t chain , hEK ) ,除用于融合蛋白切割纯化外 , L ( ) 肠激酶 En terok ina se, EK, EC 3. 4. 2 1. 9 是存 还有可能应用于人类肠激酶相关疾病的治疗或机 在于哺乳动物十二指肠内的一种丝氨酸蛋白水解 制研究. 酶 [ 1 ] , 由 1条 115 kD a 的重链和 1条 35 kD a 的轻 链组成. 重链参与该酶在肠细胞膜上的锚定 ,轻链 [ 2 ] 1　材料与方法 则具有全酶完整的催化活性 . 近年来 , 国内外 关于重组