高效液相色谱在生物医药研究中的应用第七讲生物胺的分离和测定(下)：多胺及有关化合物的分离和.pdfVIP

讲 座 高效液相色谱在生物医药研究中的应用 第七讲 生物胺的分离和测定下（）：多胺及有关化合物的分离和测定 唐琴梅 （中国科学院上海药物研究所，200031） 7-6 多胺及有关化合物的分离 化合物无紫外吸收，又无荧光和电化学活性，检测困 多胺是具有两个以上氨基的脂肪族化合物，四种 难，必须衍生后才能检测，因此多胺的分离方法与其 重要的多胺及有关化合物的名称和结构见表1。此类 衍生有关。 表7-3多胺及有关化合物的名称和结构 1．反相色谱 在柱前衍生中多胺与衍生试剂生 对多胺的容量因子 k（）影响不大，但缓冲液的离子强 成疏水的有机大分子，因此柱前衍生的多胺分离可用 度对多胺的k影响较大，离子强度增加时k减小 （图 反相色谱，常用的是C18柱[1-8]，也有用C8柱分离的 7-11）6,20]，在反相离子对色谱中，离子对试剂的浓度 报道[-10。Genner和 Skaaden等分别试验 了 增加时，多胺的t也增加 （图7-14。 LichrosorbRP-18,RP-8,RP-CN和苯基、C6C18柱，初 7-7 多胺及其有关化合物的检测 步试检表明C18柱分离效果最好[11-12] 此类化合物缺少结构检测特征，故须衍生后才能 2阳离子交换色谱 在柱后衍生中多胺的极性 进行检测。紫外检测器因缺少足够的灵敏度一般不 基团会在色谱过程中产生峰扩展，可采用阳离子交换 适宜这类生物样本的测定，目前多选择荧光检测法， 色谱进行分离[13,14]，阳离子交换色谱可将氨基酸、胺 近年来又发展了电化学检测法。 及肽与多胺分离，由于离子交换树脂的高容量，在分 1紫外检测法 紫外衍生试剂用于多胺的有对－ 析生物样品时不需对样品作复杂的预处理。 甲苯磺酰、喹啉-8-磺酰、苯甲酰氯及二甲胺基偶氮苯 3．反相离子对色谱 除了阳离子交换色谱，在柱 磺酰氯DABS-C1等，前两种衍生试剂检测灵敏度较 后衍生中还可用反相离子对色谱。多胺的结构极易 低，定量测定范围分别为2-50g及20-200ng，故不 与易离子化的有机酸如n-己、庚、辛烷磺酸及樟脑磺 能用于多胺的微量测定。苯甲酰氯和DABS-C1具有 酸等形成离子对，在洗脱液中多胺阳离子与离子对试 衍生反应迅速、衍生产物稳定和检测灵敏度高等优 剂的结合有动力学上的平衡，增加离子对试剂的浓度 点。苯甲酰氯的多胺衍生物在紫外229nm或230nm 能使平衡向生成离子对的方向移动，使多数阳离子生 处检测灵敏度可达1pmol或6ng[5,21]。DABS-C1的多 成单一型的离子对，从而避免了峰扩展。目前反相离 胺衍生物检测波长为436nm，灵敏度2pmol[8]。 子对色谱已成为柱后衍生中最常用的分离方 2荧光检测法 荧光检测法常用的衍生试剂有 法[15-19] 荧光胺（FA[1] 、邻苯二甲醛O（PA[15-19]及丹磺酰氯 4影响分离的因素 有机改性剂的浓度对多胺 DNS-C1[3,4,6,9,10]FA和OPA只能与伯胺反应，因 的保留时间t（）及分离有较大的影响，缓冲液的pH 此比DNS-C1更具选择性，且衍生反应迅速。DNS-C1 的衍生反应时间较长，但产物稳定，于暗处4℃保存 测极限可达50-150fmol[4]。FA和DNS-C1均用于柱 一个月损失不超过10ィ，检测灵敏度也较高，最小检 前衍生，OPA柱前、柱后衍生均可使用。 柱前荧光衍生物的制备： 及高专一性而广泛用于生物样本中儿茶酚胺的测定， 1荧光胺衍生物的制备[1]经预处理后的样本 近年来又开展了电化学检测器对多胺测定的研究，已 加入 0.4mol/L硼酸缓冲液 p（H9.0 0.2ml20mmol/ 取得一定的结果。多胺本身无电化学活性，但