碱性法提取质粒DNA.docVIP

碱法提取质粒DNA 一、目的 掌握微量移液器、高速离心机等的正确使用 掌握碱法提取质粒DNA的原理和方法。 二、原理 从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。首先用含一定浓度葡萄糖的缓冲液（溶液Ⅰ）悬浮菌体，再加入溶液II（NaOH、SDS）后，碱性环境下菌体的细胞壁裂解，而使质粒缓慢释放出来，并且碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主染色体DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在上清液中。然后用酚、氯仿多次抽提进一步纯化质粒 DNA 。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。再用两倍体积的无水乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿。最后用75％乙醇溶液洗涤沉淀，以去除残留的盐离子。最后获得的质粒DNA储存在TE溶液中，-20℃保存。用于下一步凝胶电泳鉴定。 三、仪器设备、材料与试剂 仪器设备 恒温培养箱 恒温摇床 台式离心机 高压灭菌锅 制冰机 电子天平pH计 量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL） 烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL） 一次性手套 无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码） 玻璃棒 称量勺 微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）酒精灯 灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL），相应的吸头盒 吸水纸 250mL三角瓶 材料： 含pKS质粒或pUC系列质粒的大肠杆菌。 四、试剂配制： 2M 葡萄糖：36g葡萄糖，溶于60ml 蒸馏水中，在加蒸馏水至100ml，然后用0.22μm滤器除菌过滤，-20℃保存。 10％SDS(十二烷基硫酸纳)：1gSDS，溶于60mL蒸馏水中（加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2）再加蒸馏水至100ml，无需灭菌。因SDS微粉易扩散，称量需戴面具。称后要及时清洁称量区。 2M NaOH：NaOH 8g，溶于10ml 蒸馏水中，再加蒸馏水至100ml。 1M Tris·HCl (pH 8.0)：蒸馏水600ml，Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl将pH调至8.0，再加蒸馏水至1000ml。 2M Tris –HCl (pH7.4)：蒸馏水300ml；Tris 121.2g；HCl 35ml；用HCl将pH调至7.4，再加蒸馏水至500ml。 0.1M EDTA (pH8.0)：18.7g EDTA-Na2-2H2O,溶于300ml蒸馏水中，用10N NaOH将pH调至8.0，加蒸馏水至500ml，室温保存。 去离子灭菌水 70%乙醇：用新开装的无水乙醇35mL，加去离子灭菌水定容至50mL配成，储存于4℃冰箱，用后即放回。 氨苄青霉素（Amp）：100mg/mL 卡那霉素（Kan）：50 mg/mL 培养基：LB液体培养基(pH 7.0)200ml分装在6个100mL体积的三角瓶内，灭菌。 母液 加入体积 终浓度 蛋白胨 2g 10g/L 酵母提取物 1g 5 g/L NaCl 2g 10 g/L 2M NaOH 0.1ml 1ml/L 蒸馏水 至200ml TE缓冲液，pH7.4，配制10ml： 母液 加入体积 终浓度 2M Tris·HCl (pH7.4) 0.05ml 10mM 0.1M EDTA (pH8.0) 0.10ml 1mM 加蒸馏水 至10ml 溶液I 配制50ml，灭菌，０～４℃保存：　　 母液 加入体积 终浓度 2M葡萄糖 1.25ml 50mmol/L 1M Tris·HCl (pH 8.0) 1.25ml 25mmol/L (pH 8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 5.0ml 10mmol/L (pH 8.0) 灭菌水 42.5ml 溶液Ⅱ (现配现用)　 配制100ml： 母液 加入体积 终浓度 2M NaOH 10ml 0.2mol/L 10％ SDS 10ml 1％ 灭菌水 80ml 溶液Ⅲ　配制100ml，灭菌，储存于4℃冰箱，用后即放回。 29.4g 乙酸钾，加50ml蒸馏水，用冰