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2017-07-21 发布于河南
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质粒消化.ppt

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质粒消化

DNA限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion;实验原理;限制性内切酶;Ⅱ类限制性内切酶;酶切反应中应注意的问题;DNA 作为内切酶底物， DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。;反应缓冲液：反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。 ;酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为37℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应，反应时间???据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=2－3：1 2小时即可，充分酶解。 ;二、实验试剂;三．实验方法; ;四．结果与分析;实验仪器;电泳检测示例;实验注意事项;思考题