通过亲和层析纯化胰蛋白酶.ppt

亲和层析法纯化胰蛋白酶 ? 第一部分 实验内容简介 ; 1 内容摘要 亲和层析包括了一整套复杂的底物及其配体与生物大分子之间相互作用时所形成的独特的生物学特性。在亲和结合的过程中涉及到疏水力、静电力、范德华力及空间阻力等因素的影响。 亲和层析的概念可以理解为配基以共价键的形式与水不溶性固体载体共价结合， 形成具有高度专一性的亲和吸附剂。以该介质为填料填充亲和层析柱，从复杂的混合物中有针对性分离某一种成分。; 本实验以亲和层析方法分离纯化猪胰蛋白酶为目的，从猪胰脏提取液中分离纯化胰蛋白酶，最终得到纯度较高的胰蛋白酶。围绕亲和层析实验所涉及的蛋白质和酶基本性质及相关技术进行综合训练。其中主要包括亲和层析介质配基的制备，亲和介质的合成，蛋白质和酶的分离纯化，酶活性的测定等内容。 通过综合训练，能够系统掌握蛋白质制备的基本原理和操作，学习如何进行实验设计，掌握实验过程中的关键环节，对实验中出现的问题进行科学的分析。使学生在学习实验技术的同时，自觉培养分析问题和解决问题能力。; 2实验目的方法 掌握蛋白质分离纯化的基本原理与操作技术 掌握亲和层析的基本原理及亲和介质合成技术 掌握胰蛋白酶活性及抑制活性测定的原理和方法 掌握消光系数法测定蛋白质的原理及计算方法 ;1. 3实验流程 ? 鸡蛋清 Spharose 4B 猪胰脏 ↓ ↓ ↓ 提取 ↓ 活化 提取 分离纯化 ↓ ↓ ↓ 纯卵粘蛋白(CHOM) →←活化Spharose 4B 胰蛋白酶原粗提液 ↓ ↓ 偶联 激活 ↓ ↓ CHOM-Spharose 4B →← 胰蛋白酶提取液 ↓ 亲和层析 ↓ 酶促动力学 ← 纯胰蛋白酶 → 酶活性测定 ↓ 酶蛋白含量测定;1. 4要求掌握的技术 柱层析技术 Sephadex G-25 分子筛层析 DEAE-Cellulose 离子交换层析 CHOM –Sepharose 4B 亲和层析 蛋白质提取技术 10%TC