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Enzyme-linked immunoabsobant assays (ELISA) 酶 免 疫 测 定 * Principle : antigen + antibody Two necessary conditions: specificity visibility Ag-Ab complex antibody as research and diagnostic tools * 目的原理 本法是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原抗体反应，从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果，可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平。 常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。 * 酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA），简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。基本的方法有三类，即间接法、双抗夹心法和抗原竞争法。 Enzyme-linked immunoabsobant assays * * 1st Ab Ag 2nd Ab substrates Colored products Enzyme 羊抗鼠IgG 鼠IgG 羊抗鼠IgG 双抗夹心法 ELISA * 实验步骤 1.?包被：取羊抗鼠IgG包被单抗20ug,用0.01M Tris-HCl稀释至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4℃过夜； 2.?封闭：用洗涤液(含0.01%Tween-20的0.01M PBS)洗涤两次,然后加入封闭液(含15%小牛血清的0.01M PBS),每孔300ul,37℃,孵育2h； 3.加样品：洗涤两次, 加入标准品鼠IgG 1ug/ml, 每孔100ul, 37℃,孵育2h； 4. 加羊抗鼠IgG-Fc-HRP: 洗涤两次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37℃孵育1h； * 5. 加底物显色：洗涤两次，加底物OPD反应液每孔100ul，置于室温5－10min； 6. 终止：加终止液2M H2SO4 50ul每孔； 7.检测及绘制标准曲线：于490nm处检测OD值，标准曲线的斜率：b＝ΣXY/ΣX2,标准曲线Y＝b·X (其中，X：浓度（标准品）；Y：比色OD值的均值)。 ８.绘制标准曲线后，通过各孔的OD值在标准曲线上相应位置计算出相应浓度 * * 注意事项 １．正式实验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制实验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。 ２．在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，包括 　　(1)　固相载体的选择： 许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管等。目前常用的是96孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。 * （2） 包被抗体(或抗原)的选择： 将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0和10μg／ml等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。 (3)　酶标记抗体工作浓度的选择： 首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 * (4)　酶的底物及供氢体的选择： 对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反应，而本身无色。有些供氢体(如OPD等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如TMB和ABTS是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以10-30分钟为宜。底物使用液必须新鲜配