实验四 PCR扩增目的基因.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * 分子生物学实验Experiments of molecular biology 实验四 PCR扩增目的基因 实验二 PCR扩增目的基因 【目的要求】 1．掌握实验原理和实验基本过程； 2．了解PCR引物设计原则；学会设计PCR引物 ； 3．了解PCR的优化环节，学会如何优化PCR。了解PCR产物的保存方法； 【实验器材】 PCR仪，台式离心机，微量移液器（10μl、 100 μl、 1000 μl ）,150μl Enpendorf管，电泳设备等 【实验材料】 pADH的PMD-20T质粒的模板，引物，4dNTP mix，Taq酶，10X PCR缓冲液、无菌水，琼脂糖，DNA染料，电泳缓冲液等。 【实验内容】 PCR基础知识介绍； PCR的基本原理； PCR引物设计原则； PCR的基本过程及程序设计； 【实验原理】 1）合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度； 2）PCR反应原理和反应过程 DNA的体外复制包括3个步骤：变性、退火和延伸，3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。 变性 Denaturation 94~95℃，1min 复性 Annealing ~55℃,1min 延伸 Extension 70~72℃,1min 72 ℃ 延伸10min DNA扩增100万倍 【操作步骤】 1. 建立PCR反应体系（依次混匀下列试剂） 组成成分 加入量（μl） DNA模板(质粒) 1 引物P1 0.5 引物P2 0.5 4XdNTP Mix 2 10XPCR缓冲液 2.5 Taq 酶 0.3 H2O 18.2 总体积 25 2. 设定PCR循环参数： Temperature Time Cycles 94 ℃ 5 min 1 94 ℃ 30 sec 20 55 ℃ 30 sec 72 ℃ 1min20sec 72 ℃ 8 min 1 3. PCR管内加好上述试剂之后要充分混合，然后离心数秒，放入PCR仪上。 4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪， 电泳。 　 PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。 电泳结果如图所示 [注意] PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 思考题 　1.降低退火温度对反应有何影响？ 　2.延长变性时间对反应有何影响？ 　3.循环次数是否越多越好？为何？ 　4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？ 对PCR的优化是必需的！！！ X ? 程序设计 开机 开机 94℃,5min 进入菜单 94 ℃,1min 55 ℃,1min 72 ℃,1min 72 ℃,5m