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第27 卷第3 期 高 校 化 学 工 程 学 报 No.3 Vol.27 2013 年 6 月 Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities June 2013 文章编号：1003-9015(2013)03-0450-06 木糖还原酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的定向整合 高 岚, 夏黎明 (浙江大学 生物质化工教育部重点实验室, 浙江大学 化学工程与生物工程学系, 浙江 杭州 310027) 摘 要：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的乙醇生产菌株，但因缺少戊糖代谢途径而不能利用木糖，为了改 良工业酿酒酵母利用半纤维素发酵生产乙醇的性能，利用分子生物学技术构建能够利用木糖的基因工程酵母。选取酿 酒酵母染色体的rDNA重复序列作为外源基因整合位点，依此构建多拷贝染色体整合型载体pUG-LR 。采用融合表达策 略扩增得到含有酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子PADH 和树干毕赤酵母木糖还原酶基因xyl1 的融合序列，并将其插入pUG-LR 载体中，构建成含遗传霉素G418 抗性标记的同源重组质粒pUG-LR-XYL1 。以工业酿酒酵母ZU-01 为宿主，通过优化 后的电穿孔法将重组质粒导入经缓冲液处理的酵母细胞，30 ℃培养。通过提高YEPX复筛培养基G418 浓度，得到 10 株生长较快的优良性状转化子。在不含G418 的YEPX培养基上传代8 次以上，以转化子基因组DNA为模板，进行PCR 检测，均可获得目的基因片段。研究结果表明：木糖还原酶基因xyl1 已定向整合于ZU-01 染色体DNA上并稳定遗传， 为后续构建工业酿酒酵母的木糖代谢通路、利用木糖产酒精的重组菌株奠定了基础。 关键词：工业酿酒酵母；木糖还原酶；基因克隆；定向整合 中图分类号：Q554.9 ；Q815 ；Q939.97 文献标识码：A DOI ：10.3969/j.issn.1003-9015.2013.03.014 Cloning of Xylose Reductase Gene and Site-Specific Integrating it into Saccharomyces cerevisiae Genome GAO Lan, XIA Li-ming (Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, Department of Chemical Engineering and Bioengineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, China) Abstract: Saccharomyces cerevisiae is an important ethanol producing fungus, but it cannot be used in large-scale bioethanol production from hemicelluloses due to its lack of the metabolism pathway of pentose, and therefore the xylose can not be utilized. In order to improve its ability of utilizing hemicelluloses to produce ethand, molecular bio