肝脏中转氨酶活力的测定.docVIP

实验九 肝脏中转氨酶活力的测定 一、实验目的 1. 了解转氨酶的性质和临床意义； 2. 掌握谷丙转氨酶活力的测定方法 二、实验原理 本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例，分别测定谷丙转氨酶，谷氨酸脱氢酶活性外，又通过抑制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙酮酸和谷氨酸。次反应可逆，平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，既可测定所产生的氨基酸，也可以测定生成的酮酸，因此可有多种测定方法。 本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收峰为 439-530nm，可用于测定丙酮酸的含量。 α-酮戊二酸也能与 2,4-二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与丙酮酸二硝基苯腙有差别，在 520nm波长比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长为520nm 处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系，故可借此测定谷丙转氨酶的活力。 三、实验材料、试剂和仪器 （一）材料与试剂 猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH 标准丙酮酸溶液（1mL 相当于500μg）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100mL 的0.05mol/L的H2SO4中，此液需临用前配制。 谷丙转氨酶底物：称取L-丙氨酸0.90g 及α-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液中，然后用1mol/L NaOH 调至pH7.4，再加pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲稀释至100mL，贮藏于冰箱内，可保存一周。（试验了一下pH 接近7.5，中间未调整pH 值） 0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.4）：称取13.97gK2HPO4（如果是K2HPO4·?H2O，则需称取18.31g）和2.69gKH2PO4 溶于1000mL 蒸馏水中。 0.02% 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼20mg 溶于少量1mol/L 盐酸中，加热溶解后，利用1mol/L 盐酸稀释至100mL。 （二）仪器/器具 电子天平、分光光度计、剪刀、移液管、组织破碎机 四、实验步骤 1. 肝匀浆制备与稀释 将猪肝用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于烧杯内，加入4.5mL 预冷的pH7.4的0.1mol/L 磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存备用。吸取上述肝匀浆1mL，加入预冷的pH7.4 的0.1mol/L 磷酸缓冲液49mL（即稀释50 倍）摇匀，作为实验中使用的稀释肝匀浆（室温中放置时间过久，会引起酶活性下降或失活因此需现用现配制，且放置时间不宜过久）。 2. 谷丙转氨酶活力的测定 （1）取试管4 支，分别标“测定管A”、“对照管B”、“标准管S”，“空白管”按下表进行操作。 测定管A 标准管S 对照管B 空白管O 谷丙转氨酶底物/mL 0.5 0.5 0 0 37℃ 保温5 min 稀释肝匀浆/mL 0.1 标准丙酮酸0.1 0.1 H2O 0.1 混匀后，37℃水浴准确保温30min 0.02% 2,4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 谷丙转氨酶底物/mL 0 0 0.5 0.5 混匀后，37℃水浴准确保温20min 0.4mol/LNaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 （2）混匀后，静置10min，于520nm波长处进行比色，以空白管调零，读取测定管A、对照管B、标准管S 的吸光度，将测定管A 吸光度减去对照管B 吸光度后与标准管S 相比算出其相当之丙酮酸含量。 （3）谷丙转氨酶活力计算：本法规定酶在37℃与底物作用30min 后，能产生2.5μg 的丙酮酸的酶量为一个谷丙转氨酶活力单位（U）。 五、实验结果 测定管A 标准管S 对照管B 空白管O 520nm吸光值 1. 每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位： 其中，D ——每毫升稀释肝匀浆谷丙转氨酶活力单位（U/mL），即肝匀浆的比活； A ——样品管的吸光度值； B ——对照管的吸光度值； S ——标准管的吸光度值； 500——标准丙酮酸溶液的浓度； 2.5——谷丙转氨酶换算单位系数。 2. 每克肝脏谷丙氨酶的活力单位 2、溶液量取过程中产生很多误差。 3、保温完后下一步骤衔接不够紧凑，时间间隔导致温度稍有下降，造成酶活性降低。 =82.353 =20588.235