Skyline 非数据依赖型采集.PDF

Skyline 非数据依赖型采集 1,2 非数据依赖型采集 (DIA) 是一项可用于进行大规模靶向蛋白质组学实验的先进技术。靶 向采集方法，例如选择性反应监测 (SRM) 和平行反应监测 (PRM)，仅可适用于一些无采 集时序安排的肽段或在有时序安排的情况下，适用于每次质谱仪运行下的数十至数百个肽 段。与SRM相比，DIA可以检测更多数量的肽段（数千或甚至整个蛋白质组），并且不严重 影响检测方法的敏感性、选择性和再现性。DIA 的另一优势是，待测量的肽段不需要提前 或计划指定，反而在广泛的母离子质荷比中，任何需要的肽段的子离子色谱图均可以在采 集后从 DIA 运行中提取。 2010年10月，Skyline首次用于从DIA 数据中提取色谱图。自此以来，这一功能已得到了 很大的改进。当前版本的 Skyline可用于多种常见的DIA数据分析方法和流程。Skyline 亦支持所有可以进行 DIA 的仪器，包括 AB SCIEX，Agilent，Bruker和Waters 的 Q-TOF 仪器和Thermo 的Q-Orbitrap 仪器。 若要使 DIA 实验富有成效，那么开始便需要在某种色谱仪和质谱仪上采用数据依赖型（D DA）的方法进行初始的数据的采集。如果这些初始鸟枪法的检测和DIA实验在同一仪器上 进行，这会大有帮助。但如果使用相似的多肽破碎技术和色谱分析发法，同一试验方法则 亦可能在不同的仪器平台之间转移。在这些初始的 DDA 实验中，样本可以被分离或进行 简化从而达到更高的蛋白质组覆盖率。多肽-谱图匹配软件将用于分析DDA 数据，而生成 的多肽序列 (ID)、谱图和保留时间会被用来创建一个谱图库和保留时间 (iRT) 库（在 S kyline 中）或创建一个加长的离子对列表（含有片段离子子集的相似信息）或者被称为 “化验物库” （在其他工具中）。这些子离子相对丰度值和标准化的保留时间 (iRT) 可 以用于任何数量的后续 DIA 实验，但这些 DIA 实验需使用相同的仪器和保留时间校准的 标准肽段。 尽管许多现有方法可以将 DDA数据的搜索结果转化为适用于DIA 分析方法的信息 （详见于 Skyline 教程网络研讨会 #2中的 “先验知识工作流”），但最直接、最方便的开始 DIA 分析的方法是将 DDA和 DIA 在相同的仪器上交叉进行，并且使用 DDA 结果的谱图和保留 时间来进行预测 DIA 的实验。任何一种可以创建包含更精准的子离子相对丰度值和标准 化的保留时间信息的库 （被称为色谱图库，详见于 Panorama 色谱图库教程）都可以被用 于根据已有的DIA结果来预测之后要进行的的 DIA实验。 在本教程中，您将学习到如何使用DDA/DIA 交叉运行的方法在 Skyline 中设置、导入和 处理 DIA 数据 （其实本教程中也包含了替代方法的指示、更多的高级方法，贯穿于本教 程中）。 1 开始 如要开始本教程，请下载下列 ZIP 文件： /tutorials/DIA.zip 请注意此文件非常大（下载内容 4.5 GB，解压后 6.0 GB），因为DIA实验经常会产生较 大的文件，通常比 SRM 实验的文件大约 大100 至 200 倍。如果此下载内容时间太长， 或如果您没有足够的磁盘空间，则您可以下载另一个较小的文件版本（下载内容 73 MB， 解压后 113 MB）： /tutorials/DIASmall.zip 如果您选择缺少质谱仪原始数据文件的较小版本，则您需要跳过本教程中的一些步骤，下 文将有注释。无论您选择哪个 ZIP 文件，下一步都是解压文件到您计算机中的一个文件 夹，如： C:\Users\damodei\Documents 这将创建一个新文件夹： C:\Users\damodei\Documents\DIA 这里会包含本教程需要的文件。你可以在资源管理器中双击或在运行的 Skyline 文档中 从文件菜单 (Ctrl-O) 中选择打开，从而打开此文件夹中的 DIABlank.sky 文件。 设置 DIA 隔离方案 您打开的 Skyline 文档应该是完全空白的，没有离子对、没有质谱仪数据、没有特殊设 置。为了阐述使用Skyline分析 DIA 数据的完整过程，您需要从头创建可适用于 DIA数据 分析的 Skyline 文档，包括填补必要的设置、离子对、谱图库和保留时间等信息。 如果您要使用 DIA 和 DDA 交叉的方法进行实验，那么您需首先为 DIA 和