实验五酵母RNA的提取及成分鉴定.PPT

实验五酵母RNA的提取及 成分鉴定（浓盐法） 实验目的 掌握浓盐法提纯RNA的基本原理和方法 了解RNA成分鉴定的原理及其方法 实验原理 核酸的分类与分布 样本的选择： RNA提取方法(浓盐法) RNA成分鉴定 RNA在强酸性条件下沸水浴加热可以水解： 1. 磷酸鉴定 2. 碱基(嘌呤)鉴定 3. 核糖鉴定 仪器试剂 仪器 实验操作 酵母RNA提取（4人一组） 3.沉淀提纯RNA RNA成分鉴定 实验结果 思考题 在酵母破壁时为什么只能水煮沸了以后再放入装有酵母和10% NaCl的三角瓶？ 本实验中两次调pH值的目的分别是什么？ 生物化学与分子生物学教研室 DNA：主要存在于细胞核的染色体中, 线粒体、叶绿体、质粒有少量 RNA：存在于细胞质中 酵母RNA（RNA占干重的3%-10%） 制备方法： 稀碱法、浓盐法 破碎细胞 提取 纯化 I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放 III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 ? V.核酸溶解在适量缓冲液或水中 制备过程： RNA以可溶性钠盐的形式游离析出 离心去除菌体,收集上清液,调至RNA的等电点（pH2～2.5） 使RNA沉淀析出，离心收集沉淀 乙醚洗涤沉淀、去除杂质、提纯RNA 浓盐加热使酵母细胞壁破裂，蛋白质变性沉淀 通过鉴定RNA的三种水解产物来鉴定RNA: 钼酸铵 磷钼酸+FeSO4 钼蓝 （蓝色） 5-甲基间苯二酚 （蓝绿色） 糠醛 精密pH试纸（pH0.5～5.0）、广泛pH试纸（pH1～14）、冰块、锥形瓶、离心机、天平、电炉 干酵母、10％NaCl、6M HCl、冰块、5％氨水、(NH4)2MoO4 试剂 1. 酵母破壁： 10％NaCl(40mL) 100mL锥形瓶 煮沸 加入干酵母（一勺） 沸水浴40min 取出冷却 玻棒搅匀 取出锥形瓶 自来水冷却后转入50mL离心管 3500rpm离心 5min 取上清 2.离心分离RNA 两两平衡后对称放入离心机中 将上清液转入小烧杯中（不可带入沉淀） 冰浴中冷却 用6M HCL调 pH值至 2.0～2.5(RNA等电点) 冰浴中静置5-10min（可见烧杯底部有大量沉淀） 轻轻摇匀后转入离心管，两两平衡后对称放入离心机 3500rpm离心5min，并收集沉淀 精密试纸 如何调pH值？ 溶解RNA 2. 水解RNA（此处开始2人一组） 加22d 1.5M H2SO4 沸水浴10min 取5ml RNA至大试管 溶液澄清 加1d蒸馏水 搅成糊状 加10ml蒸馏水搅匀 加5%氨水至pH6-7，继续滴加至沉淀完全溶解 广泛试纸 核糖鉴定： 20d水解液+20d Fe3+·HCL+2d 5%的5-甲基间苯二酚 3. RNA成分鉴定 嘌呤鉴定： 20d水解液+20d 0.1mol AgNO3 磷酸鉴定： 20d水解液+20d钼酸铵 +FeSO4结晶粉 加浓氨水至沉淀消失 +10d 浓氨水 沸水浴 15min 摇匀 沸水浴 2min 沸水浴 2-3min ？ ？ ？ （绿豆大小） 1 2 3 1号：磷酸鉴定（蓝色） 2号：碱基鉴定（红棕色） 3号：核糖鉴定（蓝绿色） 生物化学与分子生物学教研室