第七课样品全息制备.ppt

第二课 样品的全息制备; 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用 怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质 组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的 蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样 等，要达到真正的全息制备是有难度的。当然，样品制备的 方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向凝 胶电泳，需谨慎使用SDS抽提蛋白质，如果以液相色谱作为 分离手段，太多的去污剂和两性电解质不是一个好的选择。 更重要的是，样品的来源千差万别，针对不同来源的样品 (如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等)，需要采 取不同的蛋白质抽提方法。本章就常规样品的制备和不同来 源蛋白质的样品制备进行详细阐述。;实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： ● 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高。 ● 碱溶法 质粒DNA纯度低、快速、操作简便。 ● 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间。;质粒DNA的分离纯化 碱溶法： ● 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； ● 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； ● 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物； ● 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质； ● 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质； ● 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA ； ● 用无DNase的RNase去除残余的RNA；;第一节 双向凝胶电泳常规样品制备及其改进;一般来说，一种理想的有效的样品制备方法应该满足以下几点要求。 ①在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质， 包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的 多肽链形式存在。 ②避免溶解性低的蛋白质(如膜蛋白)在等电聚焦时 由于溶解度降低而沉淀析出。 ③防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白 酶或尿素热分解后所引起的修饰。 ④排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。 ⑤获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去 除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。;二、样品裂解液中各种成分分析 为获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用 促溶剂、去污剂、还原剂、IPG缓冲液和两性电解 质等将其变性并充分溶解。然而这些化学物质应满 足一些化学和电学要求，如适合IPG胶条的IEF技术、 保持蛋白质最大的溶解性和尽可能低的离子强度(等 电聚焦加以高电压时，低离子强度使得电流很低， 保证了聚焦的快速和高效)。;(一)离液剂 尿素是最常用的离液剂(chaotropic agent)，它 的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使 得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使 用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白 的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止 了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结 构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中 的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在 实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol／L 硫脲和5～8mol／L尿素联合使用。;(二)还原剂 还原剂(reducing agent)主要是用来断裂蛋白质分子中 Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的 还原剂有β—巯基乙醇、DTT或DTE(Dithioerythreit01)和 三丁基膦(TBP)等。其中DTT是使用比较广泛的还原剂，它 在50mmol／L时能有效地还原大部分的二硫键，但有些蛋 白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度， 由于它的pKa在8左右，因而会影响到pH梯度。另外，DTT 在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发 生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋 白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大 大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以 还原。;(三)去污剂 去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作 用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂 有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去 污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂TritonX-100和NP- 40，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离 子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们 各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦， 然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降 解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因 此一般只用于样品处理的初级阶段。在SD