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本次实验项目： 　　　　　　　　质粒DNA提取及检测 本次实验课时：综合性实验，　10学时 教学要求： 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 3．能够根据实验目的进行整个实验过程的操作，如质粒DNA的提取、琼脂糖凝胶浓度的确定与制备、样品配制与处理、上样量及方法的选择、电泳时电压的控制、染色时间的确定、结果分析（质粒DNA样品），总结本实验成功与失败的原因等。 重 点： 掌握碱裂解法提取质粒的实验原理、整个实验过程的操作。 难　　点：能够提出质粒 教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。 讲授内容及时间分配： 课堂讲授 1．相关知识……………………………………………………………　　……　 0.1 学时 2．实验目的…………………………………………………………………　　… 0.3学时 3．实验原理……………………………………………………………………　　 0.3 学时 4．实验操作　　　　　……………………………………………………　　… 0.3 学时 实验教学 质粒DNA提取…………………………………………………………　5　学时 DNA琼脂糖凝胶电泳……………………………………………………　5　学时 参考资料 《分子生物学实验》 实验教学教案首页 　　　　　　　 质粒DNA提取及检测 本实验属于综合性实验 设计性实验：给定实验目的、要求和实验条件，学生自己设计方案并加以实现的实验。 综合性实验：实验内容涉用本课程的综合知识或与本课程相关课程知识的实验。 实验目的：提取所给实验菌中的质粒，根据所提质粒的特点采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定质粒DNA样品；熟悉操作过程；掌握实验方法；明确实验原理。 实验要求：能够根据实验目的进行整个实验过程的操作，如质粒DNA的提取、琼脂糖凝胶浓度的确定与制备、样品配制与处理、上样量及方法的选择、电泳时电压的控制、染色时间的确定、结果分析（质粒DNA样品），总结本实验成功与失败的原因等。 实验条件 1．教师准备出所需的实验试剂和材料，有些需学生自己配制所需的试剂。 2．教师准备出本实验所需的主要实验仪器，如平板电泳槽；电泳仪；微量进液器等。 相关知识 ?DNA重组技术 ? ?包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 ?有人也将其它使细胞基因组结构得到改造的体系也包括在基因工程内以区别于DNA重组 ?常用到的工具酶： 连接酶 聚合酶 逆转录酶 核酸外切酶和核酸内切酶 DNA酶和RNA酶 拓扑异构酶 载?体 质粒plasmid）：是基因工程中常用的载体之一。是染色体外小型（1-200kb）的共价、DNA分子（cccDNA， 质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，它的复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白；常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 　　质粒的复制：质粒的复制子决定其拷贝数，包括DNA复制起点和相关的调控元件。 stringent control）：1~n个 松弛型复制（relaxed control）：　20个以上 常用的载体质粒：是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19,(500~700) 外源质粒：质粒载体（或质粒载体＋目的基因） 受体细胞：为外源基因的克隆和表达提供特定的环境和条件 提纯的思路 1、质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 2、要去的物质： 基因组DNA 脂类及小分子杂质 RNA 引起蛋白质变性及引起变性的因素 核酸变性与复性电泳：琼脂糖凝胶电泳200bp—50kb（分离范围广、方便））， 1．琼脂糖凝胶Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下。 (1) 琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不须事先处理就可进行电泳。 (2) 琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占98％～99％），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3) 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 (4) 电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。