back 酶（活力）.pptVIP

五、酶的活力测定和分离纯化 酶活力的表示方法 酶的比活力 竞争性抑制实例 反竞争性抑制 = Km [E] [S] [ES] (1) 因为 [E]、[ES] 难以测定，故用 [Et] 代表酶的总浓度 即：[Et] = [E] + [ES] [E] = [Et] – [ES] (2) 将式 (2) 代入式 (1)： 米氏方程的推导（续二） 关键二： Km ( [Et] – [ES] ) [S] [ES] = Then v = k3 [ES] [ES] = [Et] [S] [S] Km + (3) ** 酶促反应的速率由有效酶浓度、即[ES]决定 ** [ES] = v k3 (4) 将（4）代入（3），得到： 米氏方程的推导（续三） 关键三： v k3 = [Et] [S] [S] Km + Then *** 酶促反应的最大速率Vmax： 底物使酶完全饱和，即所有的酶均以ES形式存在 (5) 即：[ES] = [Et] Vmax = [Et] k3 [Et] = Vmax k3 (6) 将(6)代入(5)，得到： 米氏方程的推导（续四） v k3 = [Et] [S] Km + [S] 关键四： v = V [S] Km + [S] Km = [S] 1 V v v = V 1 + [S] Km 米氏方程的三种主要形式 Back 常数的意义 常数的测定 1、当 v = Vmax/2 时，Km = [S]。 2、是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km值，可鉴别酶。 3、当 k2 k3 时，Km值可近似表示酶和底物亲合力， Km愈小，E对S的亲合力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。 4、从Km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。 米氏常数的意义 思考题 米氏方程 Km值可近似表示酶和底物亲合力 Km ≈ k2 / k1 此时， Km可以看作 ES 的解离常数 ks Km大，说明ES容易解离， 酶与底物结合的亲和力小。 E S ES E P k1 k2 + + k3 = k2 + k3 k1 Km 当 k2 k3 时 Km = ks = [S][E] [ES] Back [S] v 底物浓度与反应速度的对应关系 1000 Km 100 Km 10 Km 3 Km 1 Km 0.33 Km 0.10 Km 0.999 V 0.99 V 0.91 V 0.75 V 0.50 V 0.25 V 0.091 V Back 思考题 1、 为什么说 Km 的单位为浓度单位？ 2、已知某酶的 Km 值为 0.05 mol·L-1，要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80％，底物浓度应为多少？ Back 基本原则：将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，再用作图法求出Km。 双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 1 Km 1 1 — = —— . — + —— v Vmax [S] Vmax 米氏常数的测定 米氏方程的双倒数形式： Back 双倒数作图法（Lineweaver-Burk法） 1/v 1/[S] 1、直线的要素 斜率 纵轴截距 横轴截距 公式 = Km/Vmax 2、作图的要求 = 1/Vmax = 1/Km Back 三、酶的抑制作用 （一）基本概念 ⊙ （二）抑制作用的类型 ⊙ （三）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别 （四）可逆抑制作用动力学 （五）一些重要的抑制剂 Back （一）基本概念 失活（Inactivation） 抑制（Inhibition） 使酶蛋白变性而引起酶活力的丧失 酶的必需基团化学性质发生改变，但酶没有变性，而导致的酶活性的降低甚至丧失 变性剂 抑制剂 选择性 无 有 抑制程度的表示方法： 不加抑制剂时的反应速率为v0，加抑制剂后的速率为vi 相对（残余）活力分数（a） a = vi / v0 抑制分数（i） 指被抑制而失去活力的分数 i = 1 - a = 1 - vi / v0 Back 记录仪／电脑 直接测定法 光源 滤光片 比色杯 传感器 酶活力测定的动力学法 常用检测指标：光吸收值、荧光强度、放射强度、pH值、离子强度 Back 酶的分离、纯化 1、酶粗提液的制备 ⊙ 2、酶的纯化 ⊙ 3、酶制剂的保存 ⊙ Back 酶粗提液的制备 （1）选材 选择酶含量丰富的新鲜生物材料，一种酶含量丰富的器官或组织往往和含量较低的器官或组织相差上千倍或上万倍。 目前常用微生物为材料制