口蹄疫病毒鞘蛋白vp1在细胞造成之讯息传递及其影响.doc

臺北市第39屆中小學科學展覽會 作品說明書封面 科　　別：生物科 組　　別：高中組 作品名稱：口蹄疫鞘蛋白VP1在細胞造成之訊息傳遞及其影響 關 鍵 詞：Integrin、Cytokine、Akt 目錄 摘要 ………………………………………………………… 研究動機 …………………………………………… 研究目的 …………………………………………… 研究設備器材 …………………………………… 研究過程方法 …………………………………… 研究結果 …………………………………………… 討論 ………………………………………………… 結論 ………………………………………………… 參考……………………………………… p.17～21 臺北市第39屆中小學科學展覽會作品說明書內容 作品名稱：口蹄疫病毒鞘蛋白VP1在細胞造成之訊息傳遞及其影響 摘要： 經實驗研究已知在大腸桿菌內表現的口蹄疫病毒（FMDV）鞘蛋白VP1，能在老鼠及人類的癌細胞內引起細胞凋亡（apoptosis），並且活化老鼠的巨噬細胞使其釋放出細胞激素（cytokine），經實驗已初步了解VP1是藉由與細胞膜蛋白結合的方式進行訊息傳導。 本實驗利用RNA干擾（RNA interference）技術成功抑制人類乳癌細胞T-47D膜上插入蛋白integrin β1的基因表現，經由細胞活性的測試，發現不表現integrin β1的細胞在經VP1處理過後，細胞的存活率較一般細胞為高；另外在老鼠巨噬細胞RAW264.7中大量表現Akt蛋白質，也可降低VP1造成的細胞凋亡；故推知VP1在細胞內的訊息傳導路徑，是先藉由與細胞膜表面的integrins進行結合，接著影響下游蛋白Akt的活性，最後啟動細胞凋亡的機制，引發細胞死亡。 本實驗亦利用反轉錄聚合酶連鎖反應（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction；RT-PCR）偵測在巨噬細胞中VP1對細胞激素（cytokine）的影響，發現VP1可在老鼠巨噬細胞J744A中引發介白素1α（interleukin-1α）、介白素1β（interleukin-1β）、介白素6（interleukin-6）以及介白素12（interleukin-12）的釋放，亦可刺激RAW264.7釋出介白素1β與介白素6，具有免疫方面的生理意義。 壹、研究動機 口蹄疫病毒（FMDV）屬於小RNA病毒科（Picornaviridae）口瘡病毒屬（Aphthovirus），是偶蹄類動物高度傳染性疾病（口蹄疫；Foot-and-Mouth Disease, FMD）的病原。中心遺傳物質由單股正鏈RNA構成，約有8000個鹼基對，可直接作為mRNA轉譯成蛋白質(7,8)。FMDV外型為正二十面體（附圖一），由稱作P1的三角狀蛋白質單元構成，P1又由VP1、VP2、VP3、VP4四個蛋白質組成（附圖二），其中VP1具有抗原性，可使宿主體內產生中抗體。而VP1上的一段胺基酸序列Arg-Gly-Asp（RGD）部位可與細胞表面的膜蛋白進行結合，加速病毒顆粒進入宿主細胞。 經由過去的實驗發現(5)，轉殖於E-coli表現並經由純化技術得到的重組VP1，可以在天竺鼠BHK-21細胞、人類胸腺癌細胞MCF-7和攝護腺癌細胞PC-3引起DNA的聚集與碎裂的現象（附圖三），進而導致計畫性細胞死亡（apoptosis），具有抗癌效果（附圖四）。但是若加入可與VP1競爭integrin的物質（ex：antibody、fibroectin），或者直接在細胞內表現VP1，皆不會造成細胞凋亡的現象，所以可推知VP1是由與細胞膜表面integrin結合的方式進行其訊息傳導，目前猜測其路徑為Akt/GSK-3β/caspase pathway。此外，VP1尚可以在老鼠巨噬細胞J744A內造成活化反應（附圖五），使其釋放出細胞激素（cytokine）。 本實驗主要以VP1與細胞膜結合的機制、與下游蛋白Akt的交互作用、活化巨噬細胞產生的cytokine及其生理意義為研究內容。 貳、研究目的 一、找出VP1與宿主細胞膜結合的機制。 二、研究VP1對細胞凋亡之相關蛋白Akt（protein kinase B；PKB）活性的調控。 三、探討VP1對巨噬細胞活化的影響及其生理意義。 參、設備及器材 一、儀器 高速離心機（MX-307, TOMY） 光電二極體分光光度計（S2100, Biowave） 真空濃縮機 可梯度聚合酶酵素連鎖反應器（Thermo Hybaid） DNA電泳槽（ADVANCE） DNA照相分析儀（IP-008-SD, VIO GENE） SDS鑄膠器 (SE245, Hoefer) 蛋白質電泳槽（Phamacia Biotech） 半乾式西方墨點