人甲状腺激素受体相互作用蛋白15的初步结晶实验及其在人组织表达 .pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（４）：２１２６ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 人甲状腺激素受体相互作用蛋白１５的初步结晶 实验及其在人组织表达的研究 １，２ １ １ 王海波 　叶雨佳 　孟照辉 （１昆明医科大学第一附属医院分子心血管病研究室　昆明　６５００３２　２北京军区总医院生物治疗中心　北京　１００７００） 摘要　目的：构建人甲状腺激素受体相互作用蛋白１５（ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ １５，ＴＲＩＰ１５）的原核表达载体，在大肠杆菌表达并纯化、结晶表达产物；证实ＴＲＩＰ１５在人脐静脉内 皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达。方法：以人肝细胞 ｃＤＮＡ文库为模板，通过 ＰＣＲ扩增ＴＲＩＰ１５的全长编码区序列，双酶切后连接到 ｐＧＥＸ６Ｐ１载体上，转化 Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１ （ＤＥ３）菌株，通过亲和层析及分子筛对表达产物进行纯化，采用气相扩散悬滴法筛选并优化结晶 条件，通过Ｘ射线晶体衍射技术检测晶体衍射；采用ＲＴＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ研究ＴＲＩＰ１５在人脐 静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤的表达情况。结果：成功构建了ＴＲＩＰ１５的原核 表达载体，获得了电泳纯ＴＲＩＰ１５蛋白，得到了蛋白质晶体，但衍射能力很弱；通过ＲＴＰＣＲ证实其 在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达。结论：成功构建了ＴＲＩＰ１５的 原核表达载体、建立了表达纯化策略并获得了初步结晶的实验条件，为最终解析其三维结构奠定 了基础；初步证实ＴＲＩＰ１５在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达，为相 关研究的开展奠定了基础。 关键词　ＴＲＩＰ１５　蛋白质结晶　基因表达 中图分类号　Ｑ８１９ 　　甲状腺激素受体相互作用蛋白１５（ｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ 肺、脑、胃、前列腺、甲状腺等组织中均存在表达［１１１２］。 ｒｅｃｅｐｔｏｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１５，ＴＲＩＰ１５）也称为 ＣＯＰＳ２、 ＴＲＩＰ１５在人前列腺癌细胞株ＬＮＣａＰ、人胚胎肾细胞株 ［２，９］ ＣＳＮ２、ＡＬＩＥＮ和ＳＧＮ２，是一个核受体家族的选择性转 ＨＥＫ２９３等细胞株中的功能研究已有报道 。Ｗｕ ［１３］ 录共抑制子，与甲状腺激素受体和维生素Ｄ 受体等核 等 通过亲和捕获联合质谱的方法研究蛋白质间相互 ３ ［１］ 作用时发现，ＴＲＩＰ１５在人脐静脉内皮细胞存在表达。 受体相互作用并抑制靶基因转录 。ＴＲＩＰ１５参与构成 ［１４］ Ｅｎｃｈｅｖ等 通过电镜技术得到了 １００?分辨率的 ＣＯＰ９信号复合体，影响其组装与功能，进而与蛋白质 ［２５］ ＣＯＰ９信号复合体的三维结构，并结合软件预测了 降解 的调节相关 。ＴＲＩＰ１５还与涉及转 录调 ［１，６７］ ［４７］ ［７８］ ＴＲＩＰ１５亚基的二级和三级结构。 节 、细胞周期调控 和ＤＮＡ损伤修复 的多种 　　本文旨在构建ＴＲＩＰ１５的原核表达载体，获得其表 ［５６