人β-分泌酶(bace1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化.pdfVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, November 25; 27(11): 1655−1666 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 - (BACE1) 王鹏，赵颖，朱平，方唯硕 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所 天然药物活性物质与功能国家重点实验室 卫生部天然药物生物合成重点实验室，北京 100050 摘 要: 为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1) ，用于研究其与抑制剂的作用模式，构建了携带β- 分泌酶proBACE1 和BACE1 编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22 和pPIC9K-MetBACE46 ，通过电击法转入 毕赤酵母 GS115 中，分别得到重组子9k-B22 和 9k-B46 。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达，结果显示 9k-B22 的上清活性明显高于9k-B46 的上清活性。9k-B22 表达上清浓缩后经HisTrap 亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的 BACE1 活性, SDS/ 高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白，并且其糖基侧链可以被Endo Hf 完全切除，得到50 kDa 左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现，这两个蛋白分别与 proBACE1 和 BACE1 匹配。活性检测发现糖基化 BACE1 和去糖基化BACE1 的活性均低于HEK-293 细胞表达的商品BACE1 ，这说明糖基化及其类型对BACE1 的活性 非常重要。然而已知的BACE1 抑制剂对三者的抑制率无显著差异，这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过 一系列培养条件优化BACE1 纯化产量提高到1 mg/L，这为发现并优化BACE1 新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。 关键词: β-分泌酶，糖基化，毕赤酵母，肽质量指纹图谱 Expression and purification of human β-secretase (BACE1) in Pichia pastoris Peng Wang, Ying Zhao, Ping Zhu, and Weishuo Fang State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines Ministry of Health Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences Peking Union Medical College, Beijing 100050, China Abstract: To generate active recombinant human β-secreatase (BACE1) for studying its interaction with its inhibitors, we constructed two recombinant plasmids, pPIC9K-MetBACE22 (bearing pro-bace1 gene) and pPIC9K-MetBACE46 (bearing bace1 gene). These two plasmids were then transformed into Pichia pastoris GS115 by electroporation to obtain the recombinant strains 9k-B22 and