重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１０）：４３～４８ 重组毕赤酵母发酵牛肉风味肽的中试研究 １，２ １ １ 曾松荣 　王艳萍 　杨　明 （１天津科技大学食品工程与生物技术学院天津市食品营养与安全重点实验室　天津　３００４５７） （２韶关学院英东生物工程学院生物科学系　韶关　５１２００５） 摘要　研究分泌表达 １６拷贝牛肉风味肽（ｂｅｅｆｙｍｅａｔｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＢＭＰ）毕赤酵母工程菌株（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５１６Ｂ２）的５００Ｌ发酵罐中试发酵工艺。在５００Ｌ发酵罐中采用三步发酵法进行了３ 批次中试发酵实验，设定菌体培养阶段温度为３０℃，ｐＨ５．０，诱导表达阶段温度为２８℃，ｐＨ３．０。 在发酵过程中通过调节搅拌速度、通气量和罐压等措施来使 ＤＯ维持在２０％～３５％左右，总共发 酵１２６ｈ（诱导时间为９６ｈ），当诱导８８ｈ后（发酵 １１８ｈ），６００ｎｍ波长下的光密度值（ＯＤ ）达到 ６００ １８４．５，菌体湿重达到３１８．７ｇ／Ｌ，目的产物ＢＭＰ的表达量达到最高为１７２ｍｇ／Ｌ，实现了ＢＭＰ的高 效表达。通过中试发酵初步建立了工程菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５１６Ｂ２的中试发酵工艺，为ＢＭＰ的进 一步研究开发奠定了良好基础。 关键词　毕赤酵母　牛肉风味肽　工程菌　中试发酵 中图分类号　ＴＱ９２０．６ 　　牛肉风味肽（ｂｅｅｆｙｍｅａｔｙｐｅｐｔｉｄｅ，ＢＭＰ）是牛肉风 源蛋白表达系统之一［４］。研究表明，工程菌发酵生产 ［１］ 的菌体生物量和外源蛋白的表达水平有一定的正比关 味的主要成分之一，１９７８年由Ｙａｍａｓａｋｉ等 采用木瓜 ［５］ 蛋白酶水解牛肉后，通过凝胶过滤和离子交换层析纯 系 。因此，Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ工程菌的高密度发酵是获得高 化从水解液中获得一个具有牛肉味的组分，其一级结 产外源蛋白的必要条件。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ工程菌的发酵培 构为 ＬｙｓＧｌｙＡｓｐＧｌｕＧｌｕＳｅｒＬｅｕＡｌａ（ＫＧＤＥＥＳＬ 养基多采用基础盐培养基（ＢＳＭ）及添加微量元素 Ａ），分子量为 ８４７道尔顿 （Ｄａ）。与谷氨酸单钠 （ＰＴＭ１）和甘油，成分简单、成本低；发酵罐的各种参数 （ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｇｌｕｔａｍａｔｅ，ＭＳＧ）即味精具有较好的协同 如ｐＨ、溶氧、温度、搅拌转速和碳源流加的速度都能精 呈味的作用，可以增强食品的鲜味，并且具有良好的热 确地控制，可以实现高密度发酵。从摇瓶培养到高密 ［２］ 度的小体积发酵培养需要大量的重复试验找出最优化 稳定性，适合于食品工业生产中的热处理要求 ，它有 望成为新一代风味强化剂。 的培养条件，小体积发酵条件确定后只需要一些调整 　　基因工程技术在食品工程领域得到了越来越多的 就能用于大批量的发酵生产，发酵的过程便于放大。 ［６］ 应用。在蛋白类香精生产方面，利用基因工程方法特 　　欧洲专利 报道了人工合成 ＢＭＰ基因，然后把 异性表达蛋白类香精具有目前酶法水解方法无法比拟 ＢＭＰ基因分别克隆到表达载体ｐＭａｌＣ２和具有信号肽 的专一性强的优点，同时也将克服目前蛋白类香精生 识别序列的表达载体 ｐＮＳ２，最后分别在大肠杆菌 产原料成分不确定，有苦味物质存在，影响产品风味等 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）中融 合 表 达 和 在 酿 酒 酵 母