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第十章 微生物系統 Microbial System 蘇 遠 志 國立台灣大學名譽教授 一、前言 隨著分子生物學的進步，科技人員已經可以利用細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細 (1) 胞、甚至植物細胞，來大量生產各種有用的蛋白質 。基因工程蛋白質是將有功能性的基因， 利用上述各種宿主及適當的表現載體，大量合成其對應的蛋白質。其應用領域包括(1)治療用 蛋白質藥物，(2)檢驗試劑用抗原，酵素或抗體片斷，(3)特用化學品，如：酵素、生物毒素， 及(4)研究用試劑。蛋白質常常與醣類形成醣蛋白，或與脂質形成脂蛋白，加上有些複雜的蛋 白質需要經過後轉譯修飾(post translational modifications) ，而這些功能則只有高等生物細胞 才具有。若要生產一複雜蛋白質藥物 (如EPO) ，則必須使用哺乳動物細胞表現系統，若作為 試劑使用，則較簡單的細菌表現系統就足夠了。影響基因工程蛋白質醱酵的因素包含(1)宿主 細胞生理，(2)啟動子(promoter) ，(3)質體複製數(plasmid copy number) ，(4)質體穩定性，(5) (2,3) 宿主/表現載體組合系統，及(6)生物反應器操作，以進行高細胞密度醱酵 。使用最多的宿 主仍為大腸桿菌及酵母菌，利用昆蟲細胞來表現外來基因的例子也越來越多。其中在使用大 腸桿菌時，有些蛋白質會形成細胞內的包涵體(inclusion body) 。由於包涵體的形成，後續的 回收必須將其溶解，並進行蛋白質再折疊(protein refolding) ，使其回復到天然的三度空間結 構，才能具有生物活性(bioactivity) 。因此在生產基因工程蛋白質時，是否為可溶性，或形成 包涵體對回收純化的設計有完全不同的考慮。由利用基因工程技術表現各種蛋白質，以高細 胞密度醱酵大量生產，再配合適合的回收純化技術，我們可以得到高純度具生物活性的蛋白 質供為各種應用。 以治療用的蛋白質藥物(protein drug) 或生物藥品(biopharmaceutical) 為例，其開發及 商品化的過程 (圖一) (4)必須經過初期的研究 (如基因選殖、表現及培養條件) ，中期的製程放 大(process scale-up) 與開發(development) ，及後期的臨床試驗(clinical trials) ，經衛生主管 機關核准後，才能上市銷售。製程放大及開發的部分，又包含醱酵、回收純化及製劑 (圖二) (5) 。產品產率的改進，規格的確定及生產標準程序(standard operating procedures) 的建立為 重點，必須能達到穩定的製程才能成為生產技術。生物藥品的雛型，必須經過嚴格的臨床前 動物試驗，才能進入人體臨床試驗。另外品質分析的方法亦必須建立，以確保每批生產出來 139 生物藥品的一致性(lot-to-lot consistency) 。 圖一、基因工程蛋白質的開發及商品化流程(4) 二、基因重組微生物宿主/載體系統的種類及選擇 利用基因工程技術，使微生物大量表現外來蛋白質(heterologous protein) 的方式很多， 但是都必須有適當的宿主/載體系統(host-vector system) 組合才能進行。其中所使用的載體 系統(vector system) 或表現系統(expression system) ，需要有一個強的啟動子，依啟動子的 功能區分，有(1)可誘導式(inducible)及(2)非誘導式(non-inducible ；constitutive)兩種。由於 基因工程蛋白質多為外來蛋白質，也就是說不是宿主細胞本身合成的分子，因此當這些外來 蛋白質在宿主細胞中大量產生時，往往會對細胞產生毒害，而致使細胞死亡。對於醱酵生產 而言，希望將宿主細胞的生長階段(growth