液相高效液相色谱法测定人血浆华法林 - 第三军医大学学报.docVIP

反相高效液相色谱法临床监测心脏瓣膜置换术后患者血浆华法林的含量 技术方法 胡茂华1 ，潘 峰 1，孙 纬1，康 简2 ，罗 婧1 ，王丽婷1 ，王 芳1（400038重庆，第三军医大学科研部中心实验室1 ；400016重庆，重庆医科大学附属第一医院心胸外科2 ） [摘要] 目的 建立心脏瓣膜置换术后患者血中华法林浓度的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC快速、准确的测定方法，便于华法林临床药物浓度监测，实现个体化给药。方法 血浆样品经正已烷-二氯甲烷（9∶1）萃取富集处理后，在310 nm紫外检测波长下，经过Hypersil BDS C18（200mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇∶水=75∶25(含0.2ml冰乙酸)；流速：0.9ml/min；柱温：25℃测定。结果 华法林的保留时间为6.41min，样品浓度线性方程为C=3.12×10-3·R+0.038，r = 0.9998，线性范围为20~2000 ng/ml，平均回收率为97.5%，日内与日间相对标准差均小于5%。对重庆地区100例心脏瓣膜置换术后患者血浆华法林测定，其血药浓度是（845.48±388.16）ng/ml。结论 本法能快速、准确的对心脏瓣膜置换术后患者血中华法林浓度，并能进行临床监测。 [关键词] 华法林；高效液相色谱法；血药浓度；心脏瓣膜置换术 华法林是一种双香豆素类抗凝血药，口服吸收完全，生物利用度达100%，与血浆蛋白的结合率为99.4%[1]。华法林通过抑制肝脏内凝血酶原和凝血因子的合成起到抗凝作用，已广泛用于血栓栓塞疾病的防治，是人工机械瓣膜置换术后预防血栓形成及体循环栓塞最常用的抗凝剂。对人工机械瓣膜置换术后血浆华法林浓度的检测，是判定口服华法林防治效果的重要指标。由于华法令用药量可以相差20倍，因此如何正确使用华法林，合理监测调整剂量，igh performance liquid chromatography，HPLC）采用甲醇和水(75∶25)作为流动相测定血浆华法林，是一种经济、快速、准确，易于操作的分析方法。该方法测定重庆地区人工机械瓣膜置换术后患者血浆华法林浓度100例，该方法的最低检测限为 5 ng/ml，能快速、准确的监测抗凝治疗患者华法林血药浓度水平，帮助医师建立个体化给药方案。 1. 材料与方法 1.1 仪器及试剂 Waters公司高效液相色谱仪，510泵，Rheodyne 7725i进样器，484紫外检测器，EC2000色谱工作站。华法林标准品，购自美国Sigma公司，甲醇为色谱纯，其他试剂为分析纯，实验用水为超纯水。 1.2 色谱条件 色谱柱：Hypersil BDS C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇∶水=75∶25(含0.2 ml冰乙酸)；流速：0.9 ml/min;柱温：25℃；紫外检测波长：310 nm。 1.3 样品收集 选择2008年5月至2010年6月西南医院、重庆医科大学附属第一医院人工机械瓣膜置换术后口服华法林抗凝治疗达稳态，服药时间3个月以上，连续3次复查凝血酶原时间、国际标准比值，在抗凝标准范围内，同时3次肝功能复查无异常的换膜患者100例，其中男性60例，女性40例，服药时间（33.83±29.36）个月，年龄4~73（45.68±13.77）岁 于末次服药15 h后采集静脉血3ml，置枸橼酸钠抗凝管中，3 000 r/min，离心10min，取血浆，-70℃冻存。入选病例在末次服药后均未发生抗凝相关的出血、溶血反应。 1.4 样品提取 取血浆1 ml置于10 ml玻璃管中，加0.5 ml 1 mol/L 的HCl, 混匀，加6 ml正已烷-二氯甲烷（9∶1），振荡5min，4 000 r/min离心5min，取有机相，室温下N2吹干，残渣加200μl流动相溶解，50μl进样作色谱分析。 2 结果 2.1 标准曲线 准确称取华法林标准品5.00 mg，用含50%甲醇的纯水溶解，定容至5 ml，其浓度为1.00 mg/ml。稀释，加入空白血浆中，华法林浓度依次为20.00、50.00、200.00、500.00、1 000.00、2 000.00 ng/ml，按1.4样品提取方法处理，华法林的保留时间为6.41min，峰面积（R）与相应浓度（C）进行线性回归，其方程为C=3.12×10-3*R+0.038，r = 0.999 8。50μl进样分析。见图1。 A：空白；B：样品 峰1：溶剂峰； 峰2：华法林 图1 华法林高效液相色谱图 2.2 华法林的回收率及精密度 在空白血浆加入3种不同浓度（20.00、500.00、2000.00 ng/ml）的华法林，求得加