教案微生物生态学-11基因工程菌的标记与跟踪.pptVIP

基因工程菌株的标记与跟踪 * GFP基因 1、绿色荧光蛋白的来源 荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物（绿色荧光）和几乎所有栉水母类的动物（蓝色荧光）在受到刺激时都可以发出荧光。 1962年，Shimomura和Johnson等人首先从水螅水母类动物Aequorea Victoria中分离、纯化出一种荧光物质，称为绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Proteins，GFPs)。 目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即Aequorea GFP和Renilla GFP (A-GFP和R-GFP）。 * 2、GFP的特性： A-GFP是球状的蛋白质，分子量为27-30KDa的单体，最高吸收峰为395nm，肩峰为473nm，发射光谱是λmax=508-509nm。 生色团的形成首先是Gly67的氨基对Ser65的羰基亲核进攻而环化成五元环，同时失去一分子水形成咪唑基。在有氧条件下，新的N=C双键促进Tyr66的α、β-氧化脱氢，从而形成一个连续的π电子芳香族系统-生色团。 * GFP生色团形成示意图 (3和4表示不同pH条件下的两种形式,4和5是同分异构体)成生色团。 * 3 荧光特性 首先，仅以蓝光或紫外光照射GFP就能激发其荧光，并不需要外加任何底物或共作用因子；荧光稳定，不易衰退，只有在过热(65℃)、过酸(pH4)、过碱(pH12-13)或其它变性剂(如6M胍基盐酸)存在的条件下GFP才会变性，荧光消失。当变性条件去除后，49%-90%以上的蛋白质能够很快复性。更重要的是，它们在很大的pH范围内(pH7-12.2)的吸收、发射光谱也是相同的。 GFP基因的表达并没有物种、细胞种类、位置的限制，而且GFP不论在真核细胞还是原核细胞中表达后，在蓝光照射下都能产生强烈荧光。 * 4、绿色荧光蛋白的优缺点 GFP是迄今为止唯一一种活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。 （1）GFP的优点： 检测方便：因为GFP荧光反应不需要外加底物、酶或其它共反应因子，GFP发射的荧光用肉眼或荧光显微镜就可以检测到，不会损伤正在生长的细胞和组织。 荧光稳定：GFP对光致漂白作用有强烈的耐受性，能耐受长时间光照，从而延长了可探测时间。 无毒害：GFP对生活细胞基本无毒害。 共用性和通用性：GFP的表达几乎没有受体范围的限制，在原核和真核生物中都获得了成功的表达，是一种在生物界较为“通用”的基因。其次，因为GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。 * （2）GFP的缺点： 正因为其荧光反应不是酶反应，所以GFP的检测不是很灵敏，而且不易对其荧光进行定量测定。 GFP基因的表达可能有假象存在：细胞本身存在一些可以受光激发的物质，能产生一定量荧光。 * 5、GFP的用途： （1）GFP基因可以作为遗传标记和报告基因； （2）GFP可用作定位标记； * GFP标记降解菌的生态学研究 * DLL-1菌启动子的筛选和GFP标记载体的构建 DLL-1总DNA A：λ-DNA/HindⅢ marker B-D：The total DNA of DLL-1 DLL-1总DNA的酶切 A：DLL-2000 marker B：The total DNA of DLL-1 C-E：Sau3AⅠdigestion of DLL-1 甲基对硫磷降解菌DLL-1的GFP发光基因标记 * 质粒基因文库质量检测 V: λ-DNA/HindⅢ marker U: pRobe-GFP A~T: the plasmids of the white colony 基因组文库的质量检测 从以上的质粒电泳均可断定外源片段的插入率为90%。说明所建文库是高质量的，足以满足普通基因文库的构建工作。 * 在紫外灯下发光的绿色菌落 启动子的筛选 * GFP标记载体的构建 45号阳性克隆 pIJGFP-45 pTRGFP-45 pBBRGFP-45 * GFP标记载体的构建 45阳性克隆 pIJGFP-45 pTRGFP-45 pBBRGFP-45 (10倍功率） * 用新构建的标记载体对甲基对硫磷降解菌DLL-1进行GFP发光基因标记 菌落在紫外灯下的发光检测(LB) A: DLLBR-45 B: DLL-1 菌落在紫外灯下的发光检测(LB) A: DLL-1 B:DLLTR-45 pBBRGFP-45 pTRGFP-45 DLL-1的标记与验证 * DLLBR-45的激光共聚焦显微镜荧光单细胞照片及荧光强度分析 DLLTR-4