大豆脲酶提取和动力学研究-袁永泽-2010-04-14.pptVIP

大豆脲酶制备与动力学研究; 一、实验目的;二、实验原理;表1 脲酶Km与来源、测定条件的关系;二、实验原理;三、实验器材与试剂;1、脲酶的提取 ① 称取5 g人造沸石，置小烧杯中，用2%乙酸浸泡两次，倾 去酸，用蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。 ② 称取10 g新鲜大豆粉，置于锥形瓶中，加上述人造沸石， 再加入50 ml 32%丙酮溶液，冰浴中持续摇动15-20 min， 4℃、10,000 rpm离心15 min，收集上清液备用。 ③ 向②中沉淀加入10 ml 32%丙酮溶液，重悬，复抽提一 次（操作同上），两次上清合并，即为粗酶液。 ;2、脲酶活性的测定 ;● 结果与分析 脲酶活力（U/ml）= 式中：n为酶样品的稀释倍数 请思考下面三个问题，这对保证本实验的完成质量很重要! ① 根据上述计算公式，脲酶活力单位如何定义？ ② 你认为上述实验获得的脲酶活性数据严格吗？如果不够 严格，你认为应如何改进实验? ③ 在测活操作中，是否有因素影响结果的准确度？如有不 利因素，应如何克服？;3、脲酶动力学研究;这里，需准备另外6只洁净的试管。; 结果与分析 △ 将测定结果列表： △ 以[S]/v对[S]作图，求取Km和Vm。 思考：上述动力学参数的求取在实验设计上是否严密？ 若不够严密，请你提出改进的方案。;② pH对脲酶催化速度的影响 ●取7只干燥试管，标以1-7序号。在1-5管中各加入0.5毫升0.1M脲溶液，再分别加入1毫升0.1M的pH5，pH6，pH7，pH8，pH9的Tris-硫酸缓冲液，室温平衡5分钟后，分别加入0.5毫升酶溶液，混匀。再于室温反应5分钟，然后在各管立即加入0.5毫升10%三氯乙酸，终止反应，混匀，按前法取出1.0 ml离心，取一定体积的上清与奈氏试剂显色。6号管加入0.3毫升标准硫酸铵溶液，7号管加入0.5毫升H2O作为空白，6、7号管各加1毫升H2O代替Tris—硫酸缓冲液。室温平衡、加酶液等操作与1~5号管同时进行。 ●分别由各管吸取0.2毫升反应液依次加入另1′—7′各管中，各加4.3毫升H2O，摇匀，再加0.50毫升奈氏试剂，摇匀。测A480，并计算反应速度。 ●以v为纵坐标，pH为横坐标作出v-pH图，求脲酶最适pH。;③ 抑制剂对脲水解速度的影响 取14只干燥试管，各管标号，按下表加样。;●同前法分别在各试管中加入0.5毫升脲酶提取液，25℃保温5分钟，立即加入0.5毫升1molH2SO4，然后煮沸至浑浊,取出静置5分钟。与此同时在14号管中制作标准。 ●从每只试管中取出0.5毫升反应液，依次加入另1′~13′试管中，各加4.30毫升H2O，摇匀，再加0.50毫升奈氏试剂，摇匀。与此同时在14号管中制作标准。 测A480，并计算反应速度。以 为纵坐标， 为横坐 标作图，由图判断磷酸盐对脲酶的抑制类型。 ;芳孩屑稻股蒸过熬狱彭组羹策舆狮列撞暴欣犊刃伏俯茄畦晃矩陈澈寨课拾大豆脲酶提取和动力学研究-袁永泽-2010-04-14大豆脲酶提取和动力学研究-袁永泽-2010-04-14