杀稻瘟菌素异源表达及其基因簇内关键基因之体内功能研究.docVIP

　　杀稻瘟菌素异源表达及其基因簇内关键基因之体内功能研究 第一章 文献综述 1.1核苷类抗生素简介 核苷类抗生素是一类由各种微生物的次级代谢产生的抗生素，它包括各种结构改造的核苷和核苷酸化合物，分子结构通常比较复杂。该类抗生素具有广泛的生物活性，包括抗细菌、抗真菌、抗锥虫、抗肿瘤、除草和增强免疫作用，且往往还具有免疫抑制性能[1]。核苷类抗生素之所以具有如此多效的作用，是因为核苷和核苷酸在大多数细胞的基础代谢途径（如代谢载体、能量供体、二级信使以及各类酶的辅因子等等）中扮演着非常重要的角色。这类抗生素也因此不仅可以干扰核酸的合成，还可以干扰蛋白、多糖和糖蛋白的合成。诸如蛋白激酶这类在细胞生长和分化过程中十分关键的酶也需要核酸作为磷酸供体，这使得核苷类抗生素可以在各个方面调控细胞的生长和分化。 1.1.1核苷类抗生素的分类 分子遗传学的研究表明，链霉菌的抗生素生物合成基因簇往往成簇排列，而且基因簇中不仅包括生物合成酶的结构基因，也包括了途径专一性的调控基因和抗性基因[2]。这一发现对于阐明抗生素生物合成机制、特定组分的产量提高以及结构的定向改造都至关重要。以核苷类抗生素为例，嘌呤霉素、多氧霉素、尼可霉素、米多霉素和杀稻瘟菌素的基因簇都已经被报道了[3‐6]。与聚酮类模块式生物合成不同[7, 8]，不同类型的核苷类抗生素生物合成基因簇的组成也不相同。只有通过生物信息学的预测，并结合体外实验验证，才可以进一步加深对于这些抗生素生物合成途径的了解[9‐11]。核苷类抗生素生物合成基因簇的多样性对于该类抗生素的定向改造造成了一定的阻碍，近年来，对这些生物合成基因簇的深入研究，使得人们可以通过分子遗传学和代谢工程的方法，在链霉菌体内合成杂合的化合物结构[12, 13]，从而得到活性更好，毒性更弱的新化合物。为了进一步阐明核苷类抗生素生物合成基因簇的特点，下面详细介绍几个已经报道的核苷类抗生素的生物合成基因簇： （1） 米多霉素生物合成基因簇 1978 年，Harada 等人首次报道了从巴布亚新几内亚的土样中分离纯化得到一株属于放线菌科链霉菌属的龟裂链轮丝菌，并在这株放线菌的发酵液中分离得到了一种新型的水溶性碱性抗生素米多霉素[14]。它是一类抗真菌抗生素，对植物白粉病有较强的防治作用，且易降解，不会对环境造成太大的影响。随后在 1981 年，Harada 等人对米多霉素的结构进行了鉴定（图 1‐16）[15]。在 1985 年报道的一篇文献中，推测米多霉素的作用机制为通过在体内阻断肽键转移来选择性的抑制某些蛋白的合成[16]。通过结构比较发现，米多霉素与杀稻瘟菌素具有类似的核心结构。由此推测米多霉素生物合成基因簇中含有与杀稻瘟菌素生物合成基因簇中基因 blsM 同源的基因。根据 blsM 及其同源基因的序列设计兼并引物，从龟裂链轮丝菌 ZJU5119中扩增到探针，并进一步从它的全基因组文库中克隆到 6 个含有探针序列的cosmid[9]。将其中的一个 cosmid，p14A6，导入到异源宿主变铅青链霉菌 1326中后实现了米多霉素的异源表达[17]。这表明 p14A6 包含了完整的米多霉素生物合成基因簇。通过对 p14A6 的测序，以及敲除实验验证，证实米多霉素生物合成基因簇一共包含了 16 个必须基因[17]（表 1‐1）。 这些基因中，milA、milB 和 milC 的功能已经通过体外实验室得到证实[9, 17]。MilA 可以将 CMP 转化成羟甲基 CMP（hydroxymehtyl CMP, HMCMP），随后 MilB将羟甲基 CMP 水解成羟甲基胞嘧啶（hydroxymehtyl cytosine，HMC）。在 MilC 的作用下，羟甲基胞嘧啶可以和 UDP‐葡萄糖醛酸结合生成羟甲基胞嘧啶葡萄糖醛酸（hydroxymehtyl cytosylglucuronic acid, HMCGA）。有意思的是，MilB 和 MilC 表现出了不同的底物偏好性。MilB可以水解HMCMP和CMP形成HMC和cytosine，而 MilC 可以催化 HMC 和 cytosine 形成 HMCGA 和 CGA。但是它们的酶动力学常数表明，对于 MilB 来说 HMCMP 具有更好的底物适应性；而对于 MilC 来说，未羟基化的 cytosine 反而是比 HMC 更好的底物（表 1‐2 和表 1‐3）。 为了验证米多霉素中精氨酸侧链的，进行了同位素标记喂养实验。在米多霉素发酵培养基中添加 C‐13 标记的精氨酸，并最终在发酵液中通过 LC‐MS 检测到了比正常米多霉素分子量大 6 的米多霉素分子。这一结果表明精氨酸是米多霉素生物合成的前体，并且保留了所有 6 个碳原子，而来自葡萄糖醛酸的碳 6则会离去。 在特定的发酵液培养基中，龟裂链轮丝